一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体；重组痘苗病毒载体带有D8L和B5R同源重组臂序列，重组病毒载体为可用来构建在痘苗病毒D8L和B5R基因区域内插入外源基因的痘苗病毒载体；本发明专利技术提供了一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，重组痘苗载体的D8L和B5R编码基因被敲除或破坏，不能正常表达D8L和B5R基因，该痘苗病毒载体可以作为肿瘤疫苗或基因治疗载体，可以用于预防或治疗多种肿瘤。瘤。瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体


[0001]本专利技术涉及分子生物学和免疫学
，具体涉及一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体。

技术介绍

[0002]痘苗病毒(Vaccinia Virus)属于痘病毒科正粘病毒属，曾被用作预防天花感染的疫苗而在世界范围内得到广泛应用，使得天花成为第一个被人类完全灭绝的恶性传染病(Riva，G.et al.，1979.Amilestone in the history of mankind.Eradication of smallpox.MMW Munch Med Wochenschr，121(50)，1669
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70)。近二十年来，随着基因工程技术的快速发展，痘苗病毒被用于研究设计基因表达载体，或用于重组活病毒疫苗的研究(Moss，B.1996.Genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety.ProcNatl Acad Sci USA 93(21)，11341
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8；Paoletti，E.et al.，1996.Applications ofpox virus vectors to vaccination：an update.Proc Natl Acad Sci USA 93(21)，11349
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53)。已有多种重组痘苗病毒疫苗可以成功地表达狂犬病毒、日本脑炎病毒等病毒的抗原并用于动物传染病的防治(Kieny，M.P.et al.，1984.Expressionof rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus.Nature312(5990)，163
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6；Konishi，E.et al.，1992.A highly attenuated hostrange
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restricted vaccinia virus strain，NYVAC，encoding the prM，E，and NS1genes of Japanese encephalitis virus prevents JEV viremia in swine.Virology190(1)，454
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8)。人用重组活病毒疫苗也取得许多重要进展，已有包括麻疹、EBV、HAV、HBV、HPV、HIV及狂犬病毒等进行了初步的人体免疫观察(郭斐等，2001，非复制重组痘苗病毒天坛株C
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K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究。病毒学报17(1)，24
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28；McMichael，A.et al.，2002.The quest for anAIDS vaccine：is the CD8+T
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cell approach feasible？Nat Rev Immunol 2(4)，283
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91；Moss，B.1996.Genetically engineered poxviruses for recombinantgene expression，vaccination，and safety.Proc Natl Acad Sci USA 93(21)，11341
‑
8；Zhu，J.H.et at.，1996.Immunogenicity and relative attenuation ofdifferent vaccinia
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rabies virus recombinants.Arch Virol 141(6)，1055
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65)。
[0003]痘苗病毒天坛株是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花传染的疫苗株在中国大量人群中长期使用过，具有相对毒力较弱、使用安全的特点，是研制适用于中国应用的基因工程病毒载体和重组活疫苗的理想毒株。中国痘苗病毒天坛株的全基因组测序于1997年完成，它为研究和阐明痘苗病毒天坛株独特的生物学特性及进行基因工程改造提供了重要的背景资料(金奇等，1997，痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析。中国科学(C辑)27(6)，562
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567)。
[0004]随着分子生物学的发展，一些病毒由于具备较好的安全性，较强的免疫原性，以及
便于基因操作的特点，作为重组病毒载体得到了广泛的研究和开发。目前主要应用于疫苗和基因治疗等医学领域。痘病毒载体自身较大，其基因组在180k左右，能容纳较大的外源基因片段，因而可作为优良的病毒载体，用于介导靶蛋白或其编码基因在体内的递送。
[0005]但痘苗病毒作为重组病毒载体，有很强的载体反应，能活化产生较强的针对痘苗病毒自身的免疫应答，其中包括强烈的中和抗体应答。而且，该应答持续时间很长，接种痘苗病毒载体疫苗的个体甚至终身具备该中和抗体应答。因而，体内存在的高水平中和抗体，将极大地影响目的重组痘苗病毒载体的再次感染，从而影响病毒载体药物投递效果。这一特点也限制了痘苗病毒载体的反复或多次应用。

技术实现思路

[0006]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术在于提供一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，重组病毒载体可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体，本专利技术重组痘苗载体的D8L和B5R编码基因被敲除或破坏，不能正常表达D8L和B5R基因，所述痘苗病毒载体可以作为肿瘤疫苗或基因治疗载体，可以用于预防或治疗多种肿瘤。
[0007]为了本专利技术的目的，以下定义下列术语。
[0008]本专利技术所称的“基因敲除”或“敲除”是一种遗传工程技术，是指利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状的技术或方法。本专利技术中，所述D8L和B5R敲除是通过分别在D8L和B5R基因内部引入突变，通过同源重组的方式分别替换痘苗病毒内源的正常D8L和B5R基因，从而使得D8L和B5R基因不能正常表达。
[0009]本专利技术所称的“重组病毒载体(Recombinant virus vector”或“重组病毒(Recombinant virus)”是指通过DNA重组技术产生，可用于生产病毒疫苗或制造基因疗法的载体。
[0010]本专利技术所称的“重组痘苗病毒载体(Recombinant vaccinia virus vector)”或“重组痘苗病毒(Recombinant vaccinia virus)”是指通过DNA重组技术产生的痘苗病毒载体或痘苗病毒，可用于生产病毒疫苗或制造基因疗法的载体。在本专利技术中，“重组痘苗病毒载体”或“重组痘苗病毒”是通过带有目的基因同源臂序列的穿梭载体与痘苗病毒在目的细胞内通过同源重组产生，然后通过重组痘苗病毒携带的报告基因或抗性基因选择而纯化得到。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述重组痘苗病毒载体的D8L和B5R编码基因被敲除，且不能正常表达D8L和B5R基因。2.根据权利要求1所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述痘苗病毒载体为复制型痘苗病毒载体或非复制型痘苗病毒载体。3.根据权利要求2所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述D8L和B5R敲除是通过分别在D8L和B5R两端的核酸序列中插入一段核酸序列，使得D8L和B5R基因突变，实施敲除，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。4.根据权利要求3所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述痘苗病毒启动子元件为P7.5或PE/L，优选地，所述P7.5的序列为SEQ ID NO:13，所述PE/L的序列为SEQ ID NO:14。5.根据权利要求4所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因。6.根据权利要求5所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述D8L两端的核酸序列分别为D8L
‑
L同源重组臂或D8L
‑
R同源重组臂，其中，所述D8L
‑
L同源重组臂序列为SEQ ID NO:1，所述D8L
‑
R同源重组臂序列为SEQ ID NO:2，所述B5R两端的核酸序列分别为B5R
‑
L同源重组臂或B5R
‑
R同源重组臂，其中，所述B5R
‑
L同源重组臂序列为SEQ ID NO:18，所述B5R
‑
R同源重组臂序列为SEQ ID NO:19。7.根据权利要求6所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述D8L和B5R敲除的重组痘苗病毒载体在D8L同源臂之间的核酸序列为SEQ ID NO:16，且在B5R同源臂之间的核酸序列为SEQ ID NO:27。8.一种用来构建的D8L和B5R基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体包括第一穿梭载体和第二穿梭载体，其中，所述第一穿梭载体含有D8L同源重组臂序列，所述第二穿梭载体含有B5R同源重组臂序列。9.根据权利要求8所述的一种用来构建的D8L和B5R基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第一穿梭载体含有D8L
–
L和D8L
‑
R同源重组臂序列，其中，所述D8L
‑
L同源重组臂序列为SEQ ID NO:1，所述D8L
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R同源重组臂序列为SEQ ID NO:2。10.根据权利要求8所述的一种用来构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建青，李雪，黄杨，
申请(专利权)人：苏州工业园区唯可达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：