柠檬酸光学探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及柠檬酸光学探针及其制备方法和应用。一方面，本发明专利技术涉及光学探针，包含柠檬酸敏感多肽B或C或其功能变体和光学活性多肽A或其功能变体，其中光学活性多肽A或其功能变体位于柠檬酸敏感多肽B或C或其功能变体的串联体之间。本发明专利技术也涉及上述探针的制备方法及其在检测柠檬酸中的应用。其在检测柠檬酸中的应用。

【技术实现步骤摘要】
柠檬酸光学探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及光学探针
，尤其涉及柠檬酸光学探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]柠檬酸是三羧酸(TCA)循环中的重要代谢物。在线粒体中，乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸的反应是三羧酸循环中十分重要的一环，可以说是整个TCA循环启动的第一步。而柠檬酸随后形成异柠檬酸使TCA循环继续进行，维持了细胞的正常生理功能。
[0003]除了参与三羧酸循环外，柠檬酸在哺乳动物细胞能量代谢方面有着关键作用。细胞内的柠檬酸盐可以通过上调或下调代谢途径上的酶，来影响糖酵解，TCA循环，糖异生和脂肪酸合成，可以改变能量的走向。例如，柠檬酸可通过抑制磷酸果糖激酶1(PFK1)和6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶(PFK2)对糖酵解产生负反馈。柠檬酸通过降低果糖-1,6-二磷酸果糖(F1,6P)的水平，也间接抑制了丙酮酸激酶。柠檬酸可以通过丙酮酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶抑制TCA循环。除了会抑制TCA循环，柠檬酸还会刺激消耗ATP的途径(如糖异生和脂质合成)，进一步减少ATP的水平。此外，它通过刺激乙酰辅酶A羧化酶，增加丙二酰辅酶A的形成，一方面，丙二酰辅酶A会诱导脂肪酸的生物合成，另一方面，丙二酰辅酶A通过肉碱棕榈酰转移酶
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来抑制脂肪酸的线粒体运输，继而抑制β-氧化。
[0004]有研究表明柠檬酸和癌症代谢、免疫细胞的活化和组蛋白乙酰化息息相关。胞外柠檬酸盐通过质膜-柠檬酸转运蛋白提供给癌细胞，如果使质膜-柠檬酸转运蛋白失活可以让癌细胞失去细胞外柠檬酸供给，肿瘤生长会减慢。但当癌细胞内柠檬酸盐在很高的水平时，柠檬酸盐会抑制PFK2，减慢了癌细胞的生长，并干扰其他细胞功能。柠檬酸和免疫细胞的活化和乙酰化有关：在巨噬细胞和树突状神经细胞的代谢中，三羧酸循环发生了变化，其结果表现为柠檬酸盐和琥珀酸盐的积累。在异柠檬酸脱氢酶催化环节发生断裂，柠檬酸在TCA循环中得到积累。大量产生的柠檬酸通过线粒体柠檬酸盐载体被输出到胞质溶胶中，随后被代谢为乙酰辅酶A。而乙酰化过程受乙酰辅酶A浓度的动态调节，柠檬酸代谢得到的乙酰辅酶A可以用于组蛋白和非组蛋白的乙酰化。在对柠檬酸转运蛋白进行突变后会削弱柠檬酸从线粒体的运输，从而导致组蛋白乙酰化的显著降低，验证了这一观点。同时，柠檬酸代谢产生的乙酰辅酶A也会上调脂质的生物合成，这对于促炎介质和消炎介质的产生都非常重要。线粒体中柠檬酸盐的代谢还与巨噬细胞中几种重要的促炎介质因子的产生有关。此外，柠檬酸盐衍生的衣康酸酯具有直接的抗菌作用，并且还显示出其作为抗炎剂的作用。
[0005]柠檬酸目前的检测方法有很多种：比如如核磁共振法、高效液相色谱法、近红外光谱法、离子色谱法、分光光度法等。这些检测分析方法或需要专业分析仪器设备，对样品的完整性造成破坏，而且大多只能应用于食品或者发酵液中的柠檬酸的检测，很难用于细胞或者体内检测，无法实时监控活细胞的柠檬酸浓度变化。因此，亟待开发新的检测方法，实现在细胞内、外，简便、快捷、特异性高的实时、定位、定量、高通量检测柠檬酸。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测柠檬酸的探针和方法。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术第一方面提供了一种融合蛋白，包括柠檬酸敏感多肽B和光学活性多肽A，其中光学活性多肽A位于两个或多个柠檬酸敏感多肽B或者C之间，形成B1-L1-A-L2-B2式的融合蛋白结构，B1和B2分别独立选自CitA或与其具有至少90％序列相同性并且保留柠檬酸敏感功能的变体和CcpE或与其具有至少90％序列相同性并且保留柠檬酸敏感功能的变体，L1和L2是接头。
[0009]在一个或多个实施方案中，CitA具有SEQ ID NO:1所示的序列，CcpE具有SEQ ID NO:2所示的序列。
[0010]在一个或多个实施方案中，光学活性多肽A选自黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白。在一个实施方式中，光学活性多肽A选自以下的任意一种或多种：具有SEQ ID NO:3的cpYFP、具有SEQ ID NO:4的cpGFP、具有SEQ ID NO:5的cpBFP、具有SEQ ID NO:6的cpmApple，和与其任一具有至少90％序列相同性并且保留荧光显色功能的变体。在一个或多个实施方案中，光学活性多肽A在N端或C端具有截短或突变。优选地，A的N端或C端具有1-5个氨基酸的截短，例如1-4个、1-3个。
[0011]在一个或多个实施方案中，L1和L2分别独立选自无、P、H、N、S、Q、A、D、Y、M、T、E、C、L、V、W、I、F、K、R、G、GS、GGS、GGGS、GSGGS、GGSGGS、GGGSGGS、RSE、GGS、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP、TWD、TLE。
[0012]在一个或多个实施方案中，B1和B2相同。
[0013]在第一方面的一个或多个实施方案中，B1和B2是CitA，A选自cpYFP、cpGFP、cpBFP、cpmApple，L1和L2选自无、G、GS、GGS、RSE、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP、TWD、TLE。优选地，A是cpYFP，L1选自无、G、GS、GGS、TWD、TLE，L2选自无、G、GS、GGS、RSE、GGS、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP。
[0014]在一个或多个实施方案中，B1和B2是CitA，A是cpYFP，L1和L2的组合选自：无/无、无/G、无/GS、无/GGS、无/RSE、无/PAP、无/PDA、无/RVR、无/RED、无/PER、无/RNA、无/PDP、无/RGA、无/RPP、G/GS、G/GGS、GS/GS、GS/GGS、GGS/GS、GGS/GGS、GS/无、GGS/无。
[0015]优选地，A是cpYFP，L1和L2的组合选自：GS/无、GGS/无。
[0016]优选地，A是cpYFP，L1和L2的组合选自：无/G、无/GS、无/GGS、无/RSE、无/GGS、无/PAP、无/PDA、无/RVR、无/RED、无/PER、无/RNA、无/PDP、无/RGA、无/RPP、G/GS、G/GGS、GS/GS、GS/GGS、GGS/GS、GGS/GGS；
[0017]更优选地，A是cpYFP，L1和L2的组合选自：无/G、无/GS、无/GGS、无/RSE、无/GGS、无/PAP、无/PDA、无/RVR、无/RED、无/PER、无/RNA、无/PDP、无/RGA、无/RPP、G/GGS、TWD/RPP、TLE/RPP。
[0018]在一个或多个实施方案中，B1和B2是CitA，A是cpGFP，L1和L2的组合选自：无/无、无/G、无/GS、无/GGS、G/无、G/G、G/GS、G/GGS、GS/无、GS/G、GS/GS、GS/G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包括柠檬酸敏感多肽B和光学活性多肽A，其中光学活性多肽A位于两个或多个柠檬酸敏感多肽B或者C之间，形成B1-L1-A-L2-B2式的融合蛋白结构，其中，L1和L2是接头，B1和B2分别独立选自(1)CitA或与其具有至少90％序列相同性并且保留柠檬酸敏感功能的变体和(2)CcpE或与其具有至少90％序列相同性并且保留柠檬酸敏感功能的变体，优选地，CitA具有SEQ ID NO:1所示的序列，CcpE具有SEQ ID NO:2所示的序列，优选地，光学活性多肽A选自以下的任意一种或多种：具有SEQ ID NO:3的cpYFP、具有SEQ ID NO:4的cpGFP、具有SEQ ID NO:5的cpBFP、具有SEQ ID NO:6的cpmApple，和与它们任一具有至少90％序列相同性并且保留荧光显色功能的变体，优选地，L1和L2分别独立选自无、P、H、N、S、Q、A、D、Y、M、T、E、C、L、V、W、I、F、K、R、G、GS、GGS、GGGS、GSGGS、GGSGGS、GGGSGGS、RSE、GGS、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP、TWD、TLE，优选地，B1和B2相同。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，B1和B2是CitA，A选自cpYFP、cpGFP、cpBFP、cpmApple，L1和L2选自无、G、GS、GGS、RSE、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP、TWD、TLE；优选地，A是cpYFP，L1选自无、G、GS、GGS、TWD、TLE，L2选自无、G、GS、GGS、RSE、GGS、PAP、PDA、RVR、RED、PER、RNA、PDP、RGA、RPP，或B1和B2是CcpE，A选自cpYFP、cpGFP、cpBFP、cpmApple，L1和L2选自无、G、P、H、N、S、Q、A、D、Y、M、T、E、C、L、V、W、I、F、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，赵玉政，李写，张秀泽，张则一，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：