可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针。本发明专利技术的引物探针组能够有效鉴别基因I型和II型两类非洲猪瘟病毒，其包括两对特异性最强、灵敏度最高的引物组合和两条探针。灵敏度最高的引物组合和两条探针。灵敏度最高的引物组合和两条探针。

【技术实现步骤摘要】
可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及非洲猪瘟病毒
，尤其涉及一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒是世界粮农组织和世界动物卫生组织高度关注的传染病之一，我国将其列为一类动物疫病病原。最初在我国暴发的非洲猪瘟病毒为基因II型，然而近期非洲猪瘟病毒I型开始在我国出现，发病更为隐蔽，危害巨大，进一步加大了我国非洲猪瘟疫情防控的难度。非洲猪瘟病毒在全世界流行已超过一百年，由于该病毒巨大，结构复杂，目前尚未研制成功有效的商品化疫苗进行免疫防控，快速、精准的诊断是防控该病的主要手段之一。目前，诊断非洲猪瘟的荧光PCR方法主要是针对该病毒p72、CD2v、MGF360等蛋白相关基因，这些方法无法区分基因I型与基因II型。
[0003]非洲猪瘟病毒基因组全长超过190bp，编码160
‑
170个蛋白，基因组序列AT含量高达70％以上，且具有很多重复序列，造成引物和探针设计难度极大。虽然非洲猪瘟病毒分型主要依据p72蛋白基因C端序列，但该段序列无法作为不同基因型分型PCR方法的靶基因。通过分析大量非洲猪瘟病毒基因I型和基因II型毒株的全基因序列，发现E296R基因相对保守，如果能在此保守区域设计出鉴别基因I型与II型的手段，则会有效提高非洲猪瘟的疫情防控。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提供一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒，目的是有效鉴定非洲猪瘟病毒I型与II型，具有灵敏度高、特异性好的特性。
[0005]基于上述目的，本专利技术提供了一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ IDNO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的基因II型探针。
[0006]本专利技术还提供一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR 检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的可鉴别基因I型与基因II 型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组。
[0007]优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增液，所述PCR扩增液通过PCR反应液和所述引物探针组配置而成。本专利技术通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分包括PCR反应液和引物探针，配成荧光PCR扩增液，直接加入模板即可进行PCR扩增。
[0008]优选的，所述PCR扩增液为8μl，且PCR扩增液中添加有15mmol的 Mg
2+
。
[0009]所述试剂盒使用的PCR反应体系为10μl，由PCR扩增液8μl和待测DNA 模板2μl组成。
[0010]本专利技术发现在PCR扩增液中加入Mg
2+
至15mmol，可有效提升高AT含量目标基因的扩增效率。为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct 值，优选的，PCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、Tris
‑
HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween
‑
20含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、 0.1％V/V、Mg
2+
15mmol、各上游引物、下游引物浓度为5μM、探针引物浓度为2.5μM、dNTPs 2.5mM和ddH2O。
[0011]优选的，所述试剂盒采用的扩增反应程序为95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，62℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。
[0012]作为一种可选的实施方式，所述第一探针与第二探针的标记用荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5，且第一探针与第二探针采用的荧光素不同。本专利技术的探针用任意一种荧光素标记，且不同探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素。
[0013]优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为含有非洲猪瘟病毒基因I型E296R基因片段的重组质粒、以及含有非洲猪瘟病毒基因 II型E296R基因片段的重组质粒，所述阴性对照为蒸馏水。
[0014]采用试剂盒检测时，当Ct值≤38，且第一探针和/或第二探针对应的通道出现特异性扩增曲线，判定含有基因I型和/或基因II型非洲猪瘟病毒。
[0015]本专利技术中，引物和探针设计针对病毒E296R基因，其中针对基因I型和基因II型的上游引物存在3个核苷酸的差异(上游引物3个核苷酸位点在基因I型和基因II型间存在差异，其中，第二个差异在基因I型中不保守)；下游引物存在1个核苷酸差异；探针存在2个氨基酸差异；两条探针5
’
端分别用HEX和FAM荧光标记，3
’
端均标记MGB来增加PCR退火温度，据此建立的荧光PCR方法可同时检测到基因I型和II型两类非洲猪瘟病毒。
[0016]非洲猪瘟病毒基因I型与II型序列比对及引物、探针设计位置如下(下划线处显示基因I型与II型存在的核苷酸差异)：
[0017][0018]本专利技术的有益效果：本专利技术的引物探针组能够有效鉴别基因I型和II 型两类非洲猪瘟病毒，其包括两对特异性最强、灵敏度最高的引物组合和两条探针。本专利技术的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测便能判定样本是否含有不同基因型的非洲猪瘟病毒，可以同时进行大批量的样本分析，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供有力的技术支持，具有重要的临床实用价值和很好的应用前景。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本专利技术的A组引物对扩增效果验证示意图；
[0021]图2为本专利技术的B组引物对扩增效果验证示意图；
[0022]图3为本专利技术的C组引物对扩增效果验证示意图；
[0023]图4为本专利技术加入5mmol的Mg
2+
对扩增效率的影响示意图；
[0024]图5为本专利技术加入15mmol的Mg
2+
对扩增效率的影响示意图；
[0025]图6为本专利技术加入30mmol的Mg
2+
对扩增效率的影响示意图；
[0026]图7为本专利技术荧光PCR特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的基因II型探针。2.一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组。3.根据权利要求2所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增液，所述PCR扩增液通过PCR反应液和所述引物探针组配置而成。4.根据权利要求3所述可鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，刘盼娆，朱振邦，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：