一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。本发明专利技术提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞的原代培养。

技术介绍

[0002]树突状细胞(DC)是最强大的抗原呈递细胞(APC)，用于激活初始T细胞并诱导针对肿瘤细胞的特异性细胞毒反应(CTL)。DC细胞在机体的免疫系统中发挥着极其重要的作用，在肿瘤免疫中的作用也逐渐被重视。基于DC的疫苗在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用，被公认为是最有前景的抗肿瘤疗法之一。此外，DC已被广泛用于测试新的分子靶向药物和免疫检查点抑制剂。
[0003]为了进一步研究DC在肿瘤免疫治疗中的作用，研究人员迫切需要大量高纯度的DC。然而，DC在各种组织和血液中含量很低，仅占人和动物血细胞的1％。体外培养骨髓来源树突状细胞(BMDC)是获得大量DC细胞的一种方法。诱导BMDC的Lutz培养法被研究人员广泛使用，但这是一种复杂且昂贵的方法，培养所获得的DC数量有限。传统BMDC的培养首先需要分离小鼠的股骨，去除附着于股骨上的肌肉，使用剪刀剪断股骨的两端后，冲洗内容物分离细胞。剪断股骨的操作中，不可避免的造成部分骨组织的丢失，从而损失部分珍贵的骨髓干细胞。调节细胞浓度后悬浮于含有20ng/ml的粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)和10ng/ml的白细胞介素
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4(IL
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4)中。由于传统的培养方法中需要多次更换培养基，造成细胞因子的大量消耗，提高了BMDC的培养成本。
[0004]因此，建立一种经济且高效的BMDC的培养方法将有利于树突状细胞的功能研究，助力抗肿瘤免疫研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是解决传统经典的BMDC培养方法较复杂、培养成本高且容易造成细胞因子大量消耗的问题，提供一种经济高效的小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种经济高效的小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0008](一)使用股骨脱臼法分离小鼠的股骨，具体如下：
[0009]脱颈法处死小鼠，使用剪刀剪开腿部皮肤，剪断股骨周围的肌肉。捏住胫骨，向外45度方向用力直至看到脱出的股骨头，剪刀分离连接的组织。从胫骨中间离断，获取游离的股骨。使用纱布通过捻搓的方法分离与股骨连接的肌肉。放置于75％乙醇中，浸泡3分钟。
[0010](二)分离骨髓干细胞，具体如下：
[0011]1.离断股骨。使用一止血钳夹住步骤(一)已分离的股骨末端1/3处，另一止血钳夹住膝关节并横向用力。由于生理结构骺线的存在，股骨从骺线处断裂。该操作将获得游离的股骨。
[0012]2.冲洗骨髓干细胞。
[0013]配制含有10％胎牛血清，10ng/ml GM
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CSF，10ng/ml IL
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4，1％青霉素
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链霉素，55μ
Mβ
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巯基乙醇的PRMI
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1640的完全培养基。
[0014]使用1ml带针注射器吸取1ml完全培养基，从断裂的骺线处刺穿残余骨质，刺入骨髓腔中，并从另一端刺出。将针头置于骨髓腔骺线处，脉冲式推动注射器，冲洗骨髓腔，直至股骨变白。
[0015](三)BMDC的诱导培养，具体如下：
[0016]收集步骤(二)中的冲洗液，加入完全培养基至24ml混匀。6孔板中每孔加入4ml的混合液体，置于37℃，5％CO2培养箱中。2天后，弃去上清液及悬浮细胞，加入等量的完全培养基。第4，6天半量更换完全培养基。第7天，收获成熟的BMDC。
[0017]本专利技术的优点和有益效果：
[0018]利用以上方法经过7天的培养每只鼠可以制备2
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107及以上成熟BMDC细胞，同时由于优化了培养步骤和细胞因子的用量，大幅降低了培养成本。本专利技术在分离小鼠股骨方面，采用剪刀离断股骨头周围肌肉，然后缓慢向外45度用力，直至看到股骨头的脱出，并进一步剪断连接的肌肉及韧带。此方法可尽可能保证股骨的完整性。使用剪刀从胫骨中段离断，获得游离的股骨。不同于传统的使用剪刀去除股骨的附着肌肉，而是使用纱布以捻搓的方式高效安全的分离肌肉。该方法的改进大幅减少了操作时间，并可获得更为洁净的股骨干。骺线作为生理性的结构，承受力量的能力较弱，在受到横向用力时容易发生骨折。我们利用股骨骺线薄弱点，两端使用止血钳横向用力使其发生骨折来分离股骨和胫骨。骺线骨折端残余少量骨质，使用1ml带针注射器可以轻松刺入骨髓腔并从股骨头端刺出。有别于传统剪断股骨两端的方法，该方法不会造成骨髓腔内细胞的丢失，为培养出大量的BMDC奠定了前期基础。由于该方法获得的骨髓干细胞的数量相对恒定，不需要在BMDC培养中额外调整细胞浓度。将冲洗液加入完全培养基至24ml，接种于6孔板中。传统的方法需要使用红细胞裂解液裂解红细胞后再进行细胞诱导培养。低渗法裂解红细胞一方面会造成骨髓干细胞损伤，另一方面多次离心造成细胞的损失。我们将含有的少量红细胞一同培养。2天后，晃动培养板，将未贴壁的细胞弃去，全部更换为新鲜的完全培养基。在本步骤中，由于红细胞和淋巴细胞不贴壁，通过换液的方式将其去除。传统方法培养2h后将未贴壁细胞去除，传统方法会丢失大量的骨髓干细胞，造成最后仅收获少量的BMDC。培养第4，6天，采取半量换液的方式，一方面保留部分细胞分泌的生长因子促进生长分化，另一方面可减少GM
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CSF和IL
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4的用量，降低BMDC的培养成本。
[0019]利用本专利技术的方法每只鼠可在6
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8天内诱导培养2
×
107以上成熟的树突状细胞。形态上，表现为大量的细胞伪足，为典型的成熟树突状细胞的表现。经流式细胞术检测发现，BMDC的纯度高，CD11c
+
阳性的细胞比例在95％以上。同时该方法培养出的BMDC高表达CD86，CD80，和MHCⅡ，说明BMDC的成熟度高，抗原递呈的能力较强，可用于体外和体内的实验研究。
[0020]本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公众含义不一致的，以本专利技术所表述的含义为准。
附图说明
[0021]图1:本专利技术涉及的BMDC诱导培养的简易流程图。
[0022]图2:BMDC随培养天数的增加其形态的改变。
[0023]图3:BMDC数量随培养时间增加的改变。
[0024]图4:成熟BMDC的典型形态的照片。
[0025]图5:随培养时间的增加CD11c
+
的细胞比例变化及统计分析。其中，A为流式直方图，依次为从第6天到第10天的CD11c
+
细胞比例变化；B为统计分析直方图。
[0026]图6:随培养时间的增加CD11c
+
，CD80
+
，MHCⅡ+...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)使用股骨脱臼法分离小鼠的股骨；(二)分离骨髓干细胞，具体如下：(1)离断股骨，使用一止血钳夹住步骤(一)已分离的股骨末端1/3处，另一止血钳夹住膝关节并横向用力，由于生理结构骺线的存在，股骨从骺线处断裂；(2)冲洗骨髓干细胞，使用1ml带针注射器吸取1ml完全培养基，从断裂的骺线处刺穿残余骨质，刺入骨髓腔中，并从另一端刺出，将针头置于骨髓腔骺线处，脉冲式推动注射器，冲洗骨髓腔，直至股骨变白；(三)小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的诱导培养(1)收集步骤(二)中的冲洗液，加入完全培养基至24ml混匀，接种于6孔板中，每孔加入4ml的混合液体，置于37℃，5％CO2培养箱中；(2)2天后，弃去上清液及悬浮细...

【专利技术属性】
技术研发人员：国林沛，解晖，杨宪法，王准，彭双鹤，唐慧琴，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：