ARL16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用制造技术

本发明专利技术提供了ARL16激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用。具体地，ARL16蛋白激动剂在制备药物中的应用，所述药物的功能为如下中的至少一种：1)预防低氧下精子鞭毛多发形态异常；2)治疗低氧下精子鞭毛多发形态异常；3)提高精子运动能力。本发明专利技术首次发现并鉴定了低氧下精子鞭毛多发形态异常新的致病基因ARL16基因，该基因通过影响精子鞭毛的逆向转运而导致男性不育，为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。异常提供了新的治疗途径。

【技术实现步骤摘要】
ARL16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用


[0001]本专利技术涉及DNA重组
，尤其涉及ARL16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用。

技术介绍

[0002]我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原，高原地区不仅自然资源丰富，也是我国社会经济发展的重要地区和戍守边疆的前沿阵地。高原低氧(低张性缺氧)环境对男性生殖功能有显著负面影响，大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(Elongating spermatid/Spermatozoa,也称为长形精子)鞭毛多形态异常现象已有报道(Liu X.etc.Biochem Biophys Res Commun,2020)。由高原低氧引起的精子鞭毛多形态异常继而造成精子前向运动能力降低严重威胁着高原男性人群生殖健康，其直接后果是畸形精子症、弱畸形精子症，严重者可导致男性不育；畸形精子症的不育患者大多存在精子的表观遗传失稳，比如H3K9me3组蛋白甲基化丰度下降及富含组蛋白甲基化的基因启动子减少等(Wang,S.Y.etc.Nat Commun,2016)。因此深入研究高原低氧下精子鞭毛多发形态异常(Hypoxic multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,HMMAF)中的表观遗传机制，探索有效控制低氧下精子鞭毛多形态异常发生的策略，对于设计高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义，对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。
[0003]HMMAF是男性不育的常见表现之一，药物治疗效果不佳，部分患者需要实施辅助生殖技术达到生育目的，其特征是精子鞭毛表型异常(如无鞭毛、短鞭毛、卷曲鞭毛、弯曲鞭毛和/或不规则鞭毛口径等)，从而导致精子活动能力严重受损。研究提示精子鞭毛多发形态异常(MMAF)多为鞭毛超微结构异常，其病因多数与基因变异密切相关。由于人类精子结构复杂，精子鞭毛中存在1000种以上的蛋白，研究认为MMAF可能包含多种不同的超微结构病变，存在不同的病因和致病基因，MMAF精子形态学差异可能源于不同的遗传学缺陷。目前已鉴定出20余种导致MMAF和不育的突变基因，主要包括：激酶A锚固蛋白(AKAP)家族基因、动力蛋白轴丝重链基因(DNAH)家族基因、CFAP家族基因、TTC家族基因、FSIP2基因、CEP135基因、SPEF2基因、QRICH2基因、AK7基因、ARMC2基因等。但对于低氧下导致的精子鞭毛多形态异常患者的遗传病因尚不明确。因此，对于HMMAF的遗传学病因和致病机理并不明确，仍需进一步探索。
[0004]ARL16蛋白(ADP
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ribosylation factor
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like 16)属于Ras GTPase超家族成员，目前研究认为ARL16蛋白以GTP依赖性的方式来抑制RIG
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I介导的抗病毒固有免疫信号通路。但关于ARL16蛋白的其他功能和作用机制尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种ARL16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用，其解决了现有技术中HMMAF药物治疗效果不佳，HMMAF的遗
传学病因和致病机理不明确的问题。
[0006]本专利技术一方面，提供ARL16蛋白激动剂在制备药物中的应用，所述药物的功能为如下中的至少一种：
[0007]1)预防低氧下精子鞭毛多发形态异常；2)治疗低氧下精子鞭毛多发形态异常；3)提高精子运动能力。
[0008]进一步地，所述ARL16蛋白激动剂包括增强ARL16蛋白的活性或表达的制剂，其中，所述ARL16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步地，所述制剂包括小分子化合物、核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体中的任一种。
[0010]优选地，所述核酸分子所述核酸分子为以ARL16蛋白的编码基因为靶序列、通过PCR扩增得到的产物；
[0011]所述PCR扩增用到的引物如SEQ ID NO.2
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3所示。
[0012]优选地，所述表达载体为重组腺病毒载体。
[0013]进一步地，所述ARL16蛋白激动剂通过促进ARL16蛋白与DYNACTIN2竞争结合DYNEIN2，来促进精子鞭毛内逆向转运。
[0014]本专利技术另一方面，提供一种ARL16蛋白激动剂，所述ARL16蛋白激动剂为能增强ARL16蛋白的活性或表达的重组腺病毒颗粒。
[0015]进一步地，所述重组腺病毒颗粒的制备方法为：构建ARL16过表达的重组腺病毒载体，经包装得到重组腺病毒颗粒。
[0016]优选地，所述重组腺病毒载体为Adeasy016
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pAdEasy
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CMV
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mArl16
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6xhis
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CMV
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EGFP。
[0017]本专利技术再一方面，提供一种试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂用于定量检测ARL16蛋白的表达水平，所述试剂盒用于诊断低氧下精子鞭毛多发形态异常。
[0018]相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]本专利技术首次发现并鉴定了ARL16蛋白在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用，并对其机制进行了研究，发现该蛋白通过与DYNACTIN2竞争结合DYNEIN2，以促进精子鞭毛内逆向转运，避免了DYNACTIN2运载的货物在鞭毛尾段聚集，从而保持了精子鞭毛的正常形态。本专利技术通过对低氧下精子鞭毛多发形态异常小鼠精子的ARL16基因的过表达，发现其精子的形态异常和运动能力得到改善，由此推测，ARL16基因在低氧下精子鞭毛多发形态异常中起着重要作用，从而为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例1中Western blot检测附睾尾精子中ARL16表达效果图；
[0021]图2为本专利技术实施例2中Adeasy016
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pAdEasy
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CMV
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mArl16
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6xhis
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CMV
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EGFP的载体图谱；
[0022]图3为本专利技术实施例4中小鼠精子细胞中GFP荧光效果图；其中，488nm通道表示ARL16表达质粒，555nm通道表示ARL16染色；
[0023]图4为本专利技术实施例4中小鼠精子细胞中ARL16表达的Western blot效果图；
[0024]图5为本专利技术实施例5中巴氏染色观察的精子畸形图；
[0025]图6为本专利技术实施例5中透射电镜观察精子中鞭毛中心体结构图；
[0026]图7为本专利技术实施例6中IF检测精子中DYNEIN2和DYNACTIN2定位，其中，7A为DYNEIN2定位，7B为DYNACTIN2定位；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ARL16蛋白激动剂在制备药物中的应用，所述药物的功能为如下中的至少一种：1)预防低氧下精子鞭毛多发形态异常；2)治疗低氧下精子鞭毛多发形态异常；3)提高精子运动能力。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ARL16蛋白激动剂包括增强ARL16蛋白的活性或表达的制剂，其中，所述ARL16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂包括小分子化合物、核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体中的任一种。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为以ARL16蛋白的编码基因为靶序列、通过PCR扩增得到的产物；所述PCR扩增用到的引物如SEQ ID NO.2
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3所示。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体为重组腺病毒载体。6.如权利要求1
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5任一项所述的应用，其特征在于，所述ARL16蛋白激动剂通过促进...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷骏，倪兵，张梦洁，
申请(专利权)人：重庆艾令达生物医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：