本发明专利技术提供了一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法。具体地，本发明专利技术提供了包含绿色荧光蛋白折叠单元和索玛鲁肽或其活性片段的融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白表达量显著提高，并且，本发明专利技术融合蛋白中的绿色荧光蛋白折叠单元可以被蛋白酶消化成小片段，和目的蛋白相比分子量差别大，容易分离。本发明专利技术还提供了利用该融合蛋白制备索玛鲁肽的方法及制备中间体。蛋白制备索玛鲁肽的方法及制备中间体。
【技术实现步骤摘要】
一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法
[0001]本专利技术涉及生物医药领域，更具体地涉及一种索玛鲁肽衍生物及其制备方 法。
技术介绍
[0002]糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方 式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急 慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患 者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]索玛鲁肽是由Novo Nordisk开发的一种降糖药物，该产品能显著降低2型糖 尿病患者的糖化血红蛋白(HbA1c)水平及减轻体重，同时大大降低低血糖的 风险。Semeglutide是通过对GLP-1(7-37)进行修饰和改造获得。与Liraglutide相 比，Semeglutide的脂肪链更长，疏水性增加，但是Semeglutide经过短链的PEG 修饰，亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4 酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。
[0004]索玛鲁肽的CAS号：910463-68-2，英文名Semaglutide，其序列如下： H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Le u14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(PEG2-PEG2-γ-Glu-Octadecanedioic acid)-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31
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OH。
[0005]专利申请号为CN201611095162，其采用片段缩合的方法合成得到全保护索 玛鲁肽，裂解后获得索玛鲁肽粗肽。由于该方法采用片段进行缩合，其原料不 易获得，且成本高昂。另外，先缩合主链至第5位的Thr，再脱除20位Lys的侧链 保护基团Alloc，进行侧链的缩合。此方法在合成过程中易造成片段2树脂的缩 聚，大大降低20位Lys后的氨基酸及片段1的偶联效率，且易产生消旋杂质，不 利于工业化生产。
[0006]专利申请号为CN201511027176，采用固相合成方法获得全保护索玛鲁肽树 脂，经裂解后获得索玛鲁肽粗肽，经纯化获得索玛鲁肽精品。此方法采用先缩 合主链，再脱除Lys侧链保护基团Alloc，进行侧链的缩合。此方法在合成过程 中易造成树脂的缩聚，大大降低偶联效率，且易产生消旋杂质，特别是造成最 后一个氨基酸His的消旋，大大降低了产品的收率，增加了生产成本。
[0007]因此，本领域技术人员致力于新的方法生产索玛鲁肽。
技术实现思路
[0008]本专利技术的目的在于提供一种索玛鲁肽衍生物及其应用。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供了一种索玛鲁肽前体融合蛋白，所述的索玛鲁肽融 合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构：
[0010]A-FP-TEV-EK-G
ꢀꢀꢀ
(I)
[0011]式中，
[0012]“-”
代表肽键；
[0013]A为无或前导肽序列，
[0014]FP为绿色荧光蛋白折叠单元；
[0015]TEV为第一酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点(如序列ENLYFQG所示，SEQ ID NO:8)；
[0016]EK为第二酶切位点，较佳地为肠激酶酶切位点(如序列DDDDK所示，SEQ ID NO:9)；
[0017]G为索玛鲁肽前体或其片段；
[0018]其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元：
[0019][0020][0021]在另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、 u3-u4-u5或u4-u5-u6。
[0022]在另一优选例中，所述G为Boc修饰的索玛鲁肽前体，所述的索玛鲁肽前体缺 失索玛鲁肽主链N端的2-7个氨基酸，并且，所述的索玛鲁肽前体中包含的赖氨酸 被Boc修饰。
[0023]在另一优选例中，所述Boc修饰的赖氨酸的ε氨基是用叔丁氧羰基修饰的。
[0024]在另一优选例中，所述的索玛鲁肽主链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0025]在另一优选例中，所述的索玛鲁肽前体包括：
[0026]第14位被Boc修饰的索玛鲁肽第一前体，所述第一前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0027]第15位被Boc修饰的索玛鲁肽第二前体，所述第二前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0028]或者，第16位被Boc修饰的索玛鲁肽第三前体，所述第三前体的氨基酸序列如 SEQ ID NO:23所示。
[0029]SEQ ID NO:1：TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(GLP-1(13-37))
[0030]SEQ ID NO:2：FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(GLP-1(12-37))
[0031]SEQ ID NO:23：TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(GLP-1(11-37))
[0032](K为Boc修饰的赖氨酸)
[0033]在另一优选例中，所述的索玛鲁肽前体C端第4位氨基酸为精氨酸或赖氨酸。
[0034]在另一优选例中，所述的索玛鲁肽前体C端第4位精氨酸可以被赖氨酸取代。
[0035]在另一优选例中，所述的融合蛋白C端第4位氨基酸为精氨酸或赖氨酸。
[0036]在另一优选例中，所述的融合蛋白C端第4位精氨酸可以被赖氨酸取代。
[0037]在本申请中，定义完整的索马鲁肽序列(H(Aib)EGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLVRGRG，SEQ ID NO:3)为索玛鲁肽主链，N端氨基酸缺失的索马鲁肽 定义为索玛鲁肽前体。对于Fmoc修饰的索玛鲁肽主链，其N端的H被Fmoc修饰；对 于Boc修饰的索玛鲁肽主链，其第20位赖氨酸为Nε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸。
[0038]在另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u3-u4-u5。
[0039]在另一优选例中，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0040]在另一优选例中，所述索玛鲁肽前体的第14位、第15位或第16位为Nε-(叔丁氧 羰基)-赖氨酸。
[0041]在本专利技术的第二方面，提供了一种Fmoc和Boc修饰的索玛鲁肽主链，其特征在 于，所述索玛鲁肽主链的第20位为保护赖氨酸，所述的保护赖氨酸为Nε-(叔丁氧羰 基)-赖氨酸，并且，所述索玛鲁肽主链的N端为Fmoc修饰的组氨酸。
[0042]在另一优选例中，所述的Fmoc为芴甲氧羰基。
[0043]在另一优选例中，所述的索玛鲁肽主链本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种索玛鲁肽前体融合蛋白，其特征在于，所述的索玛鲁肽融合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构：A-FP-TEV-EK-G
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(I)式中，
“-”
代表肽键；A为无或前导肽序列，FP为绿色荧光蛋白折叠单元；TEV为第一酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点(如序列ENLYFQG所示，SEQ ID NO:8)；EK为第二酶切位点，较佳地为肠激酶酶切位点(如序列DDDDK所示，SEQ ID NO:9)；G为索玛鲁肽前体或其片段；其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元：β-折叠单元氨基酸序列u1VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO:11)u2HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO:12)u3KLTLKFICTT(SEQ ID NO:13)u4YVQERTISFKD(SEQ ID NO:14)u5TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:15)u6TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO:16)u7HNVYITADKQ(SEQ ID NO:17)u8GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO:18)u9VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO:19)u10HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO:20)u11HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO:21)。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述G为Boc修饰的索玛鲁肽前体，所述的索玛鲁肽前体包括：第14位被Boc修饰的索玛鲁肽第一前体，所述第一前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；第15位被Boc修饰的索玛鲁肽第二前体，所述第二前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者，第16位...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，张振山，吴松，怀汉青，
申请(专利权)人：宁波鲲鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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