基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺，应用于生物技术领域。基于大肠杆菌表达系统的复杂性：表达产物、表达方式、表达载体、菌株和发酵罐各不相同，使用的培养基和培养工艺也复杂多样；同时，试验室工艺放大到生产后，目的产物的表达量往往很低；针对这些问题，本发明专利技术提供了一种广谱的培养基和工艺：能够适用于绝大多数基因工程大肠杆菌的高密度发酵，针对不同条件的生产设备，也能实现目的蛋白的大量表达，实现现有设备的最大利用率。最大利用率。最大利用率。

【技术实现步骤摘要】
基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺


[0001]本专利技术属于生物领域，特别涉及一种大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺。

技术介绍

[0002]基因工程是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定地遗传。随着技术的进步，目前已经能将目的蛋白在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞等模式生物中实现表达。生物医药领域已经在广泛的使用基因工程技术，选择不同的蛋白表达系统来获得所需的目的产物。
[0003]在众多表达系统中，原核蛋白表达是最常见的表达系统，也是最经济实惠的表达系统。其中大肠杆菌表达系统以遗传背景清楚、成本低、表达量高和产物分离纯化相对简单等优点，被广泛应用于抗原、抗菌肽、酶制剂、核酸疫苗等的制备，据资料和报道，在动物疫苗行业，越来越多抗原的制备使用基因工程大肠杆菌表达，如鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、猪圆环病毒(PCV)、猪链球菌(SS)、副猪嗜血杆菌(HPS)、禽腺病毒(FADV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、犬细小病毒(CPV)、猪水泡病病毒(SVDV)、塞内卡病毒(SVA)等病。
[0004]虽然利用大肠杆菌表达系统培养的都是基因工程大肠杆菌，在摇瓶中使用普通的LB等一系列简单的培养基就能够实现表达，但由于表达产物的复杂多样性，放大到生产后，目的蛋白的表达量却很低。为了实现大规模生产，往往会用到不同的培养基和发酵工艺，甚至专门研发对应工程菌的高密度发酵培养基和发酵工艺。相关基因工程大肠杆菌高密度发酵的专利有：如申请公布号为CN 110819582 A的“大肠杆菌表达口蹄疫病毒样颗粒抗原的发酵培养基及培养方法”，申请公布号为CN 107937459 A的“一种规模化产TRIM72蛋白的高密度方法”等一系列的专利，都是针对某一特定的表达产物，且使用的培养基和培养工艺也相差较大，目前未见能够适用于不同基因工程大肠杆菌菌株高密度发酵的培养基和发酵工艺。生物医药方面的研发投入很大，且利用基因工程大肠杆菌生产的公司往往会有多个系列的基因工程大肠杆菌表达的产品，重复的研发也导致了资源的极大浪费。一些从科研院所或者其他公司转项目进行生产的公司，由于生产硬件设备的差异，要么放大不到生产，要么生产达不到预期效果，导致项目停滞，或者难以实现项目的转化预期。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种广谱的基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺，该培养基和工艺能够适用于绝大多数基因工程大肠杆菌高密度发酵，针对不同条件的生产设备，也能实现目的蛋白的大量表达，实现现有设备的最大利用率。
[0006]本专利技术采用的技术方案之一为：一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，包括基础培养基、C源补料培养基、诱导补料培养基；
[0007]所述基础培养基组分：
[0008][0009][0010]C源补料培养基组分：
[0011][0012]诱导补料培养基组分：
[0013][0014]所述基础培养基制备过程为：
[0015]A1、根据基础培养基能够达到的最高发酵密度、能收获的最高细菌量与发酵罐硬件条件能达到的最高发酵密度、能收获的最高细菌量的比例，确定一份基础培养基的配置比例；
[0016]A2、将步骤A1中配置好的基础培养基成分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入发酵罐；
[0017]A3、对转入发酵罐的基础培养基溶液进行灭菌，从而得到基础培养基；采用的灭菌温度为116℃，灭菌时间为30min。
[0018]所述C源补料培养基制备过程为：将一份C源补料培养基组分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入补料瓶；然后设置培养基溶液灭菌温度116℃，灭菌时间30min，得到C源补料培养基。
[0019]所述诱导补料培养基制备过程为：将诱导补料培养基组分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入补料瓶；然后设置培养基溶液灭菌温度116℃，灭菌时间30min，得到诱导补料培养基。
[0020]本专利技术采用的技术方案之二为：基因工程大肠杆菌高密度发酵工艺，包括如下步骤：
[0021]步骤1：将灭菌好的C源补料培养基和诱导补料培养基分别通过硅胶管连接在发酵罐上，通过补料泵控制；将配置好的无菌NaOH溶液通过碱补料泵与发酵罐相连调节基础培养基pH，一般10L以下小罐使用浓度2M，500L以上大罐使用浓度20M；
[0022]步骤2：接种前，设置好发酵温度、通气量和转速。使用碱补料泵将pH控制在细菌最佳生长pH。当一切参数稳定后进行接种；
[0023]步骤3：接种后，每小时记录发酵罐溶氧、pH、转速和通气量，每小时测量细菌生长OD值、湿重和活菌数；
[0024]步骤4：发酵时，发酵罐设置起始转速确保不产生气泛现象，一般在200rpm以上。通气量开至1个VVM(即每分钟通气量与发酵液体积比为1)。发酵过程中当溶氧低于30％时，先通过提高转速维持溶氧在30％，当转速达到最高时，再通过缓慢提高通气量维持溶氧在
30％；
[0025]步骤5：发酵的0
‑
4小时，设置补料泵流加C源补料培养基，每小时流加量(1～1.4)
×
发酵体积(发酵体积单位L)，单位ml。发酵4小时以后，调整C源补料泵流速，每小时流加量(4.5～5)
×
发酵体积(发酵体积单位L)，单位ml；
[0026]步骤6：当细菌OD值与基础培养基能生长的最高OD值相差不到5个OD值时，将温度、pH和溶氧调整为诱导最佳值，待参数稳定后，加入诱导剂进行诱导表达；
[0027]步骤7：诱导时，设置诱导培养基补料泵进行补料，每小时流加量(10～15)
×
发酵体积(发酵体积单位L)，单位ml；
[0028]步骤8：达到最佳诱导时长，停止发酵，收获菌体。
[0029]本专利技术的有益效果：采用本专利技术的培养基及培养工艺，能实现高密度发酵，也能根据不同发酵罐的硬件条件进行简单调整，实现更高密度发酵或低密度发酵，杜绝了资源的浪费，同时保证目的蛋白的高表达；并且本专利技术具有广谱性，能够用于绝大多数基因工程大肠杆菌高密度发酵，不论是表达抗原还是抗菌肽和酶等使用本专利技术均能取得满意的结果。
附图说明
[0030]图1为高密度发酵3批次与批次式发酵3批次平均菌泥收获量对比图；
[0031]图2为高密度发酵3批次与批次式发酵3批次单位菌泥目的蛋白表达量对比图；
[0032]图3为高密度发酵与厂家原工艺发酵细菌生长情况对比图；
[0033]图4为高密度发酵与厂家原工艺发酵单位菌泥目的蛋白酶活对比图；
[0034]图5为高密度培养基与2
×
YT培养基发酵洗后菌泥收获量对比图；
[0035]图6为高密度培养基与2
×
YT培养基发酵目的蛋白纯度对比图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，根据基础培养基、C源补料培养基、诱导补料培养基配比而成；所述基础培养基由如下组分制备而成：所述C源补料培养基由以下组分制备而成：
所述诱导补料培养基由以下组分配比而成：2.根据权利要求1所述的一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述基础培养基的制备方法包括：A1、根据基础培养基能够达到的最高发酵密度、能收获的最高细菌量与发酵罐硬件条件能达到的最高发酵密度、能收获的最高细菌量的比例，确定一份基础培养基的配置比例；A2、将步骤A1中确定的基础培养基成分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入发酵罐；A3、对转入发酵罐的基础培养基溶液进行灭菌，从而得到基础培养基。3.根据权利要求2所述的一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，步骤A3采用的灭菌温度为116℃，灭菌时间为30min。4.根据权利要求3所述的一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述C源补料培养基制备过程为：将一份C源补料培养基组分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入补料瓶；然后对转入补料瓶的C源补料培养基溶液进行灭菌，得到C源补料培养基。5.根据权利要求4所述的一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，采用的灭菌温度为116℃，灭菌时间为30min。6.根据权利要求5所述的一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，所述诱导补料培养基制备过程为：将一份诱导补料培养基组分添加至三分之二体积的纯水中，搅拌至无固体颗粒后再定容，转入补料瓶；然后对转入补料瓶的诱导补料培养基溶液进行
灭菌，得到诱导补...

【专利技术属性】
技术研发人员：扶星星，王科，刘瑞，赵小欢，钟彬，黎宏，吴福文，王永胜，
申请(专利权)人：四川百诺吉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：