治疗病毒性肺炎的细胞制剂制造技术

本发明专利技术涉及治疗病毒性肺炎的方法。具体地说，一方面，本发明专利技术涉及一种细胞制剂，其中包含胎盘间充质干细胞和药用溶媒，所述药用溶媒是水，该细胞制剂是供注射方式使用的制剂，所述胎盘间充质干细胞是经传代培养至1~20代的细胞，所述胎盘间充质干细胞的浓度为(0.5~10)

【技术实现步骤摘要】
治疗病毒性肺炎的细胞制剂


[0001]本专利技术属于生物技术和生物医药领域，涉及治疗病毒性肺炎的方法，尤其是涉及使用间充质干细胞配制的细胞制剂治疗病毒性肺炎的方法，使用间充质干细胞配制成的细胞制剂，以及将该细胞制剂用于治疗病毒性肺炎的用途。

技术介绍

[0002]肺炎，尤其是病毒性肺炎，是由上呼吸道病毒感染、向下蔓延所致的肺部炎症。该病一年四季均可发生，但大多见于冬春季节，可暴发或散发流行。临床主要表现为发热、头痛、全身酸痛、干咳及肺浸润等。病毒性肺炎的发生与病毒的毒力、感染途径以及宿主的年龄、免疫功能状态等有关。一般小儿发病率高于成人。
[0003]急性呼吸道感染中，病毒感染占90％，而病毒感染则以上呼吸道为主，有普通感冒、咽炎、喉
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气管
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支气管炎、细支气管炎、婴儿疱疹性咽峡炎以及流行性胸痛等。引起肺炎的病毒不多见，其中以流行性感冒病毒为常见，其他为副流感病毒、巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒和某些肠道病毒，如柯萨奇、埃可病毒等，以及单纯疱疹、水痘
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带状疱疹、风疹、麻疹等病毒。婴幼儿还常由呼吸道合胞病毒感染产生肺炎。病毒性肺炎多发生于冬春季节，可散发流行或暴发。在非细菌性肺炎中，病毒感染占25％～50％，患者多为儿童，成人相对少见。
[0004]近年来由于免疫抑制药物广泛应用于肿瘤、器官移植，以及艾滋病的发病人数逐年增多等，单纯疱疹病毒、水痘
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带状疱疹病毒、巨细胞病毒等，都可引起严重的肺炎。病毒性肺炎为吸入性感染，通过人与人的飞沫传染，主要是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致，常伴气管
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支气管炎，家畜如马、猪等有时带有某种流行性感冒病毒，偶见接触传染。粪经口传染见于肠道病毒，呼吸道合胞病毒通过尘埃传染。器官移植的病例可以通过多次输血，甚至供者的器官引起病毒。血行播散的病毒性肺炎并不伴气管
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支气管炎。
[0005]病毒性肺炎的临床表现一般较轻，与支原体肺炎的症状相似。起病缓慢，有头痛、乏力、发热、咳嗽、并咳少量黏痰。体征往往缺如。X线检查肺部炎症呈斑点状、片状或均匀的阴影。白细胞总数可正常、减少或略增加。病程一般为1～2周。在免疫缺损的患者，病毒性肺炎往往比较严重，有持续性高热、心悸、气急、发绀、极度衰竭，可伴休克、心力衰竭和氮质血症。由于肺泡间质和肺泡内水肿，严重者可发生呼吸窘迫综合征。体检可有湿啰音。X线检查显示弥漫性结节性浸润，多见于两下 2/3肺野。
[0006]病毒性肺炎的诊断依据为临床症状及X线改变，并排除由其他病原体引起的肺炎。确诊则有赖于病原学检查，包括病毒分离、血清学检查以及病毒抗原的检测。呼吸道分泌物中细胞核内的包涵体可提示病毒感染，但并非一定来自肺部，需进一步收集下呼吸道分泌物或肺活检标本作培养分离病毒。血清学检查常用的方法是检测特异性IgG抗体，如补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验，但仅能作为回顾性诊断，并无早期诊断价值。
[0007]有关病毒性肺炎现有的治疗手段仍然是有局限，因此，研究开发安全、有效的新的临床治疗方案一直是该领域的热点和难点问题。
[0008]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于人脐带、胎盘或羊膜的间充质干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制；它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化；而且细胞在体外易于扩增，扩增后分化能力、增殖能力保持稳定，适合大规模制备。近年来，国内外初步研究结果显示，MSCs有治疗病毒性肺炎的生物学效果，这可能为病毒性肺炎的临床治疗带来巨大变革。
[0009]从胎盘或脐带来源获取干细胞的技术已相当成熟。现有技术已公开了诸多从人胎盘或脐带制备间充质干细胞的方法，例如，CN109481466A(中国申请号201811568010X)记载了详细的胎盘间充质干细胞获取方法，CN102660497B(中国专利号ZL2012101599162)记载了详细的脐带间充质干细胞获取方法，其全部内容通过引用并入本文。
[0010]尽管已有报道使用间充质干细胞治疗病毒性肺炎的尝试，然而这些方法仍然具有其局限性。因此，提供一种更有效的使用间充质干细胞治疗病毒性肺炎的新方法，仍然是本领域技术人员迫切期待的。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种围产组织来源的间充质干细胞，尤其是胎盘来源的间充质干细胞，制备成的干细胞制剂，通过给病毒感染病毒性肺炎小鼠静脉注射间充质干细胞制剂，已经出人意料地发现，能够显著改善肺部生理改变。本专利技术基于此类发现而得以完成。
[0012]为此，本专利技术第一方面提供了一种细胞制剂，其中包含胎盘间充质干细胞和药用溶媒。
[0013]根据本专利技术第一方面所述的细胞制剂，其中所述胎盘间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
[0014](1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水；
[0015](2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；
[0016](3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min；移去上清，细胞沉淀加DMEM
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F12 重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM
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F12冲洗滤网，得40ml
细胞悬液，作为原代细胞；
[0017](4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；
[0018](5)细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞制剂，其中包含胎盘间充质干细胞和药用溶媒。2.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述胎盘间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；所述的组织清洗液是包含1%双抗的0.9%生理盐水；(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15~30ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min；移去上清，细胞沉淀加DMEM
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F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM
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F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱中以37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养；每隔3
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4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；所述完全培养基是包含10%FBS的DMEM
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F12培养基；(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2
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5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000~12000个细胞/cm2，置CO2培养箱以37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养至细胞密度达90%以上，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。3.根据权利要求2的细胞制剂，其中：步骤(2)中，所述的混合酶消化液中包含：15~30体积的Hank
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s平衡盐溶液、0.2~0.6体积的Libera...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，王正，汤乐，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：