接近性保留性转座制造技术

本文中提供的实施方案涉及用于制备靶核酸的条形码化DNA片段的固定化文库，鉴定基因组变体，测定靶核酸的接近性信息、定相信息、和甲基化状态的方法和组合物。甲基化状态的方法和组合物。甲基化状态的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
每个所述寡核苷酸包含互补捕捉序列和第一条形码序列，并且其中来自所述 多个固体支持物中的每个固体支持物的所述第一条形码序列不同于来自所 述多个固体支持物中的其它固体支持物的所述第一条形码序列。将所述条形 码序列信息转移至所述靶核酸片段，使得相同靶核酸的至少两个片段接受相 同条形码信息。测定所述靶核酸片段的序列和所述条形码序列。通过鉴定所 述条形码序列测定所述靶核酸的接近性信息。在一些实施方案中，在转座和 随后转座子的衔接头序列与互补捕捉序列杂交后除去转座体复合物的转座 酶。在一些实施方案中，通过SDS处理除去转座酶。在一些实施方案中，通 过蛋白酶处理除去转座酶。
[0011]在一个方面，本文中描述了用于同时测定靶核酸序列的定相信息和甲基 化状态的方法。方法包括使所述靶核酸与多个转座体复合物接触，每个转座 体复合物包含：转座子和转座酶，其中所述转座子包含转移链和非转移链， 其中所述转座体复合物的至少一个转座子包含衔接头序列，所述衔接头序列 能够与互补捕捉序列杂交。将所述靶核酸片段化成多个片段，并且将多个转 移链插入靶核酸片段中，同时维持所述靶核酸的接近性。使所述靶核酸的所 述多个片段与多个固体支持物接触，所述多个中的每个固体支持物包含多个 固定化寡核苷酸，每个所述寡核苷酸包含互补捕捉序列和第一条形码序列， 并且其中来自所述多个固体支持物中的每个固体支持物的所述第一条形码 序列不同于来自所述多个固体支持物中的其它固体支持物的所述第一条形 码序列。将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段，使得相同靶核酸的 至少两个片段接受相同条形码信息。对包含条形码的所述靶核酸片段进行亚 硫酸氢盐处理，从而生成经亚硫酸氢盐处理的包含条形码的靶核酸片段。测 定所述经亚硫酸氢盐处理的靶核酸片段的序列和所述条形码序列。通过鉴定 所述条形码序列测定所述靶核酸的接近性信息。
[0012]在一个方面，本文中描述了制备有标签的DNA片段的固定化文库的方 法。方法包括提供多个固体支持物，所述固体支持物具有其上固定化的转座 体复合物，其中所述转座体复合物是多聚体的，并且相同转座体复合物的所 述转座体单体单元彼此连接，并且其中所述转座体单体单元包含与所述第一 多核苷酸结合的转座酶，所述第一多核苷酸包含(i)包含转座子端序列的3
’ꢀ
部分，和(ii)包含第一条形码的第一衔接头。在条件下将靶DNA应用于所述 多个固体支持物，从而通过所述转座体复合物使所述靶DNA片段化，并且将 所述第一多核苷酸的3
’
转座子端序列转移至所述片段的至少一条链的5
’
端； 由此生成双链片段的固定化文库，其中至少一条链是用所述第一条形码在5
’ꢀ
加标签的。
[0013]在一个方面，本文中描述了制备测序文库以测定靶核酸的甲基化状态的 方法。方法包括将所述靶核酸片段化成两个或更多个片段。将第一共同衔接 头序列掺入所述靶核酸的片段的5
’
端，其中所述衔接头序列包含第一引物结 合序列和亲和力模块(moiety)，其中所述亲和力模块在结合对的一个成员中。 使所述靶核酸片段变性。在固体支持物上固定化所述靶核酸片段，其中所述 固体支持物包含所述结合对的另一个成员，并且通过所述结合对的结合固定 化所述靶核酸。对所述固定化靶核酸片段进行亚硫酸氢盐处理。将第二共同 衔接头序列掺入经亚硫酸氢盐处理的固定化靶核酸片段，其中所述第二共同 衔接头包含第二引物结合位点。扩增固体支持物上固定化的经亚硫酸氢盐处 理的靶核酸片段，从而生成测序文库以测定靶核酸的甲基化状态。
[0014]在一个方面，本文中描述了制备测序文库以测定靶核酸的甲基化状态的 方法。方
法包括提供多个固体支持物，所述固体支持物包含其上固定化的固 定化转座体复合物。所述转座体复合物包含转座子和转座酶，其中所述转座 子包含转移链和非转移链。所述转移链包含：(i)在3
’
端的第一部分，其包含 转座酶识别序列，和(ii)位于所述第一部分的5
’
的第二部分，其包含第一衔 接头序列和结合对的第一成员。所述结合对的所述第一成员结合所述固体支 持物上的所述结合对的第二成员，从而将所述转座子固定化至所述固体支持 物。所述第一衔接头还包含第一引物结合序列。所述非转移链包含：(i)5
’ꢀ
端的第一部分，其包含转座酶识别序列，和(ii)位于所述第一部分的3
’
的第 二部分，其包含第二衔接头序列，其中3
’
端的末端核苷酸被封闭。所述第二 衔接头还包含第二引物结合序列。使靶核酸与包含固定化转座体复合物的所 述多个固体支持物接触。将所述靶核酸片段化成多个片段，并且将多个转移 链插入所述片段的至少一条链的5
’
端，从而将所述靶核酸片段固定化至所述 固体支持物。用DNA聚合酶延伸片段化的靶核酸的3
’
端。将所述非转移链与 所述片段化靶核酸的3
’
端连接。对所述固定化靶核酸片段进行亚硫酸氢盐处 理。通过使用DNA聚合酶延伸所述亚硫酸氢盐处理期间损伤的固定化靶核酸 片段的3
’
端，使得所述固定化靶核酸片段的3
’
端包含同聚体尾 (homopolymeric tail)。将第二衔接头序列掺入所述亚硫酸氢盐处理期间损伤 的固定化靶核酸片段的3
’
端。使用第一和第二引物扩增固体支持物上固定化 的经亚硫酸氢盐处理的靶核酸片段，从而生成测序文库以测定靶核酸的甲基 化状态。
[0015]在一个方面，本文中公开了制备测序文库以测定靶核酸的甲基化状态的 方法。方法包括a.使所述靶核酸与转座体复合物接触，其中所述转座体复合 物包含转座子和转座酶。所述转座子包含转移链和非转移链。所述转移链包 含(i)在3
’
端的第一部分，其包含转座酶识别序列，和(ii)位于所述第一部分 的5
’
的第二部分，其包含第一衔接头序列和结合对的第一成员，其中所述结 合对的所述第一成员结合所述结合对的第二成员。所述非转移链包含：(i)5
’ꢀ
端的第一部分，其包含所述转座酶识别序列，(ii)位于所述第一部分的3
’
的 第二部分，其包含第二衔接头序列，其中3
’
端的末端核苷酸被封闭，并且其 中所述第二衔接头包含第二引物结合序列。将所述靶核酸片段化成多个片 段，并且将多个转移链插入所述片段的至少一条链的5
’
端，从而将所述靶核 酸片段固定化至所述固体支持物。使包含所述转座子末端的靶核酸片段与包 含所述结合对的第二成员的所述多个固体支持物接触，其中所述结合对的第 一成员与所述结合对的第二成员的结合将所述靶核酸固定化至所述固体支 持物。用DNA聚合酶延伸所述片段化的靶核酸的3
’
端。将所述非转移链与所 述片段化的靶核酸的3
’
端连接。对所述固定化的靶核酸片段进行亚硫酸氢盐 处理。通过使用DNA聚合酶延伸所述亚硫酸氢盐处理期间损伤的固定化靶核 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备靶核酸的条形码化DNA片段的文库的方法，其包括：a.使靶核酸与多个转座体复合物接触，每个转座体复合物包含：转座子和转座酶，其中所述转座子包含转移链和非转移链，其中所述转座体复合物的至少一个转座子包含衔接头序列，所述衔接头序列能够与互补捕捉序列杂交；b.将所述靶核酸片段化成多个片段，并且将多个转移链插入所述片段的至少一条链的5
’
端，同时维持所述靶核酸的接近性；c.使所述靶核酸的所述多个片段与多个固体支持物接触，所述多个中的每个固体支持物包含多个固定化寡核苷酸，每个所述寡核苷酸包含互补捕捉序列和第一条形码序列，并且其中来自所述多个固体支持物中的每个固体支持物的所述第一条形码序列不同于来自所述多个固体支持物中的其它固体支持物的所述第一条形码序列；d.将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段，从而生成双链片段的文库，其中至少一条链是用所述第一条形码在5
’
加标签的，其中相同靶核酸的至少两个片段接受相同条形码信息。2.用于测定靶核酸序列的接近性信息的方法，所述方法包括：a.使所述靶核酸与多个转座体复合物接触，每个转座体复合物包含：转座子和转座酶，其中所述转座子包含转移链和非转移链，其中所述转座体复合物的至少一个转座子包含衔接头序列，所述衔接头序列能够与互补捕捉序列杂交；b.将所述靶核酸片段化成多个片段，并且插入多个转移链，同时维持所述靶核酸的接近性；c.使所述靶核酸的所述多个片段与多个固体支持物接触，所述多个中的每个固体支持物包含多个固定化寡核苷酸，每个所述寡核苷酸包含互补捕捉序列和第一条形码序列，并且其中来自所述多个固体支持物中的每个固体支持物的所述第一条形码序列不同于来自所述多个固体支持物中的其它固体支持物的所述第一条形码序列；d.将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段，其中相同靶核酸的至少两个片段接受相同条形码信息；e.测定所述靶核酸片段的序列和所述条形码序列；f.通过鉴定所述条形码序列测定所述靶核酸的所述接近性信息。3.用于同时测定靶核酸序列的定相信息和甲基化状态的方法，所述方法包括：a.使所述靶核酸与多个转座体复合物接触，每个转座体复合物包含：转座子和转座酶，其中所述转座子包含转移链和非转移链，其中所述转座体复合物的至少一个转座子包含衔接头序列，所述衔接头序列能够与互补捕捉序列杂交；b.将所述靶核酸片段化成多个片段，并且插入多个转移链，同时维持所述靶核酸的接近性；c.使所述靶核酸的所述多个片段与多个固体支持物接触，所述多个中的每个固体支持物包含多个固定化寡核苷酸，每个所述寡核苷酸包含互补捕捉序列和第一条形码序列，并且其中来自所述多个固体支持物中的每个固体支持物的所述第一条形码序列不同于来自所述多个固体支持物中的其它固体支持物的所述第一条形码序列；d.将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段，其中相同靶核酸的至少两个片段接受相同条形码信息；
e.对包含条形码的所述靶核酸片段进行亚硫酸氢盐处理，从而生成经亚硫酸氢盐处理的包含条形码的靶核酸片段；f.测定所述经亚硫酸氢盐处理的靶核酸片段的序列和所述条形码序列；g.通过鉴定所述条形码序列测定所述靶核酸的接近性信息，其中所述序列信息指示所述靶核酸的甲基化状态，并且所述接近性信息指示单元型信息。4.权利要求1
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3中任一项的方法，其中单一条形码序列存在于每个单独的固体支持物上的所述多个固定化寡核苷酸中。5.权利要求1
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3中任一项的方法，其中不同条形码序列存在于每个单独的固体支持物上的所述多个固定化寡核苷酸中。6.权利要求1
‑
5中任一项的方法，其中通过连接将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段。7.权利要求1
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5中任一项的方法，其中通过聚合酶延伸将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段。8.权利要求1
‑
5中任一项的方法，其中通过连接和聚合酶延伸两者将所述条形码序列信息转移至所述靶核酸片段。9.权利要求7
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8中任一项的方法，其中所述聚合酶延伸是通过使用连接的固定化寡核苷酸作为模板用DNA聚合酶延伸非连接转座子链的3
’
端。10.权利要求1
‑
9中任一项的方法，其中所述衔接头序列的至少部分进一步包含第二条形码序列。11.权利要求1
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10中任一项的方法，其中所述转座体复合物是多聚体的，并且其中每个单体单元的转座子的所述衔接头序列不同于相同转座体复合物中的其它单体单元。12.权利要求1
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11中任一项的方法，其中所述衔接头序列还包含第一引物结合序列。13.权利要求12的方法，其中所述第一引物结合序列与所述捕捉序列或与所述捕捉序列的互补物没有序列同源性。14.权利要求1
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13中任一项的方法，其中所述固体支持物上的所述固定化寡核苷酸进一步包含第二引物结合序列。15.权利要求1
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14的方法，其中所述转座体复合物是多聚体的，并且其中所述转座体单体单元在相同转座体复合物中彼此连接。16.权利要求15的方法，其中转座体单体单元的所述转座酶与相同转座体复合物的另一个转座体单体单元的另一个转座酶连接。17.权利要求15的方法，其中转座体单体单元的所述转座子与相同转座体复合物的另一个转座体单体单元的转座子连接。18.权利要求1
‑
17中任一项的方法，其中靶核酸序列的所述接近性信息指示单元型信息。19.权利要求1
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17中任一项的方法，其中靶核酸序列的所述接近性信息指示基因组变体。20.权利要求19的方法，其中所述基因组变体选自下组：缺失、易位、染色体间基因融合、重复(duplication)、和旁系同系物(paralog)。
21.权利要求1
‑
20中任一项的方法，其中所述固体支持物上固定化的所述寡核苷酸包含部分双链区和部分单链区。22.权利要求21的方法，其中所述寡核苷酸的所述部分单链区包含所述第二条形码序列和所述第二引物结合序列。23.权利要求1
‑
22中任一项的方法，其中在测定所述靶核酸片段的序列前扩增包含所述条形码的靶核酸片段。24.权利要求23的方法，其中在测定所述靶核酸片段的序列前在单一反应区室中实施步骤(a)
‑
(d)和后续扩增。25.权利要求23的方法，其中在所述扩增期间将第三条形码序列引入所述靶核酸片段。26.权利要求1
‑
25中任一项的方法，其进一步包括：将来自多个第一组反应区室的步骤(d)的包含所述条形码的所述靶核酸片段组合成包含所述条形码的靶核酸片段的合并物；将包含所述条形码的靶核酸片段的所述合并物再分配到多个第二组反应区室；通过在测序前在所述第二组反应区室中扩增所述靶核酸片段将第三条形码引入所述靶核酸片段中。27.权利要求1
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26中任一项的方法，其进一步包括在使所述靶核酸与转座体复合物接触前将所述靶核酸预先片段化。28.权利要求27的方法，其中通过选自下组的方法将所述靶核酸预先片段化：超声处理和限制性消化。29.制备有标签的DNA片段的固定化文库的方法，其包括：(a)提供多个固体支持物，所述固体支持物具有其上固定化的转座体复合物，其中所述转座体复合物是多聚体的，并且相同转座体复合物的转座体单体单元彼此连接，并且其中所述转座体单体单元包含与第一多核苷酸结合的转座酶，所述第一多核苷酸包含(i)包含转座子端序列的3
’
部分，和(ii)包含第一条形码的第一衔接头，(b)在条件下将靶DNA应用于所述多个固体支持物，从而通过所述转座体复合物使所述靶DNA片段化，并且将所述第一多核苷酸的所述3
’
转座子端序列转移至所述片段的至少一条链的5
’
端；由此生成双链片段的固定化文库，其中至少一条链是用所述第一条形码在5
’
加标签的。30.权利要求29的方法，其中转座体单体单元的所述转座酶与相同转座体复合物的另一个转座体单体单元的另一个转座酶连接。31.权利要求29的方法，其中转座体单体单元的所述转座子与相同转座体复合物的另一个转座体单体单元的转座子连接。32.制备测序文库以测定靶核酸的甲基化状态的方法，其包括：a.将所述靶核酸片段化成两个或更多个片段；b.将第一共同衔接头序列掺入所述靶核酸的片段的5
’
端，其中所述衔接头序列包含第一引物结合序列和亲和力模块(moiety)，其中所述亲和力模块在结合对的一个成员中；c.使所述靶核酸片段变性；d.在固体支持物上固定化所述靶核酸片段，其中所述固体支持物包含所述结合对的另
一个成员，并且通过所述结合对的结合固定化所述靶核酸；e.对所述固定化靶核酸片段进行亚硫酸氢盐处理；f.将第二共同衔接头序列掺入经亚硫酸氢盐处理的固定化靶核酸片段，其中所述第二共同衔接头包含第二引物结合位点；g.使用第一和第二引物扩增固体支持物上固定化的经亚硫酸氢盐处理的靶核酸片段，从而生成测序文库以测定靶核酸的甲基化状态。33.权利要求32的方法，其中通过一侧转座将所述第一共同衔接头序列掺入所述靶核酸的5
’
端片段。34.权利要求32的方法，其中通过连接将所述第一共同衔接头序列掺入所述靶核酸的所述5
’
端片段。35.权利要求32
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34中任一项的方法，其中将所述第二共同衔接头序列掺入经亚硫酸氢盐处理的固定化靶核酸片段包括：(i)使用末端转移酶延伸所述固定化靶核酸片段的3
’
端，使得所述固定化靶核酸片段的3
’
端包含同聚体尾；(ii)杂交包含第一部分和第二部分的寡核苷酸，其中所述第一部分包含单链同聚体部分，其与所述固定化的靶核酸片段的同聚体尾互补，并且其中所述第二部分包含双链部分，其包含所述第二共同衔接头序列；(iii)将所述第二共同衔接头序列与所述固定化靶核酸片段连接，从而将所述第二共同衔接头序列掺入经亚硫酸氢盐处理的固定化靶核酸片段。36.权利要求1
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35中任一项的方法，其中所述靶核酸来自单一细胞。37.权利要求1
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36中任一项的方法，其中所述靶核酸来自单一细胞器。38.权利要求1
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37中任一项的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。39.权利要求1
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38中任一项的方法，其中所述靶核酸与其它核酸交联。40.权利要求1
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39中任一项的方法，其中所述靶核酸是无细胞的肿瘤DNA。41.权利要求40的方法，其中从胎盘流体获得所述无细胞的肿瘤DNA。42.权利要求40的方法，其中从血浆获得所述无细胞的肿瘤DNA。...

【专利技术属性】
技术研发人员：FJ斯蒂莫斯，KL冈德森，张帆，JR贝特利，NA戈姆利，W穆尔曼，J韦尔，A约安努，G詹金斯，R杰克逊，N莫雷尔，DK波科洛克，SJ诺伯格，M何，A基亚，I戈里辛，R潘托加，
申请(专利权)人：伊卢米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：