基于SNP技术检测河流型水牛β-casein基因型的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于检测SNP多态性对β

【技术实现步骤摘要】
基于SNP技术检测河流型水牛
β
‑
casein基因型的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体是一种涉及荧光PCR扩增识别靶标基因SNP的分型及选育优良河流型水牛的方法。

技术介绍

[0002]牛乳蛋白还被认为是牛奶中生物活性肽的最重要来源之一，具有强大生物活性的肽可能通过肠道中蛋白水解酶的作用从乳蛋白中释放出来，从而影响包括内分泌，神经，消化，心血管和免疫系统在内的主要身体系统。50多年前，Aschaffernburg和Drewry首次发现了乳蛋白的基因多态性，他们以β
‑
LG为对象，找出了两种基因型，不同的基因型，在产奶量、产奶品质和周期上都有明显不同。此后越来越多的学者开始研究乳蛋白基因多态性，近几年，由于新检测方法的应用乳蛋白基因多态性的研究得到了飞速发展，并发现了多达9种变构型，河流型水牛主要为四种乳蛋白基因型(A、B、C、D)。因此可通过筛选优势的乳蛋白基因型来筛选优良奶源的品种。
[0003]目前乳蛋白的基因型分选方法主要分为：
[0004]蛋白水平的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、免疫印迹、毛细管电泳、双向电泳及等点聚焦等方法。
[0005]DNA水平的聚合酶链反应单链构象多态、限制性片段长度多态性聚合酶链反应、微卫星及焦磷酸测序等技术。
[0006]上述方法较为费时、费力和高成本。
[0007]蛋白水平的方法灵敏度和稳定性不如DNA水平，本专利技术采用DNA水平的KASP对SNP分型的方法实现高通量、高准确率、低成本的对β
‑
casein基因进行分型。

技术实现思路

[0008]本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，本专利技术采用DNA水平的KASP对SNP分型的方法实现高通量、高准确、低成本的对乳蛋白的基因型进行分型。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]一种基于SNP技术检测河流型水牛β
‑
casein基因型的方法，包括如下步骤：
[0011]步骤S1：提取样品DNA；
[0012]步骤S2：电泳DNA，检测DNA的质量；
[0013]步骤S3：制备PCR反应体系，体系内包括大于20％体积分数的DNA样品、1.4％体积分数的混合引物，以及余量的KASP混合液；
[0014]步骤S4：进行PCR扩增；
[0015]其中，步骤S3中添加的混合引物包括6种KASP引物，分别为β
‑
casein基因型SNP1的三种和SNP4的三种，即SNP1有一种未突变的基因型、两种突变基因型，SNP4有一种未突变的基因型、两种突变的基因型；突变基因引物及未突变基因引物中，一条带HEX荧光标签，另一条带FAM荧光标签,经过PCR扩增后，检测DNA样品的荧光强度，从而进行基因分型。
[0016]进一步说明，所述步骤S2中，所添加的混合引物包括四组，其用于分别检测四处突变位点的碱基类型，并且，针对不同的突变位点，设计的引物如下：
[0017](1)待检测β
‑
casein_80位点上的碱基类型时，引物序列：
[0018]SNP1
‑
Primerl：
[0019]GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGCAGAGCTCAGAAGCGC；
[0020]SNP1
‑
Pr imer2：
[0021]GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTGCAGAGCTCAGAAGCGT；
[0022]SNP1
‑
Pr imerCommon：
[0023]AGGCCCAGGGCAAGCAGGAG；
[0024](2)待检测β
‑
casein_55位点上的碱基类型时，引物序列：
[0025]SNP4
‑
Primerl：
[0026]GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGCCCAGGGCAAGCAGGAGG；
[0027]SNP4
‑
Pr imer2：
[0028]GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGCCCAGGGCAAGCAGGAGA；
[0029]SNP4
‑
Pr imerCommon：
[0030]TTGCAGAGCTCAGAAGCG。
[0031]进一步说明，(1)待检测β
‑
casein_80位点上的碱基类型，如果扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度，则该位点上两条链均未突变；如果扩增后仅出现对应HEX荧光强度，则该位点上两条链均突变；如果扩增后出现两种混合荧光强度，则该位点上两条链一条突变，一条未突变；
[0032](2)待检测β
‑
casein_55位点上的碱基类型时，如果扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度，则该位点上两条链均未突变；如果扩增后仅出现对应HEX荧光强度，则该位点上两条链均突变；如果扩增后出现两种混合荧光强度，则该位点上两条链一条突变，一条未突变。
[0033]进一步说明，所述步骤S4中，PCR扩增的步骤包括：
[0034]步骤S41：预变性，温度94摄氏度，时间15分钟，进行1个循环；
[0035]步骤S42：变性，94摄氏度，20秒；延伸，61
‑
55摄氏度，时间60秒，进行10个循环；
[0036]步骤S43：在温度为94摄氏度时变性20秒，55摄氏度时退火和延伸60秒，26个循环。
[0037]进一步说明，所述步骤S1所述，样品DNA的提取方法(酚氯仿提取法)包括：
[0038]步骤S11：对组织或血液材料进行预处理；
[0039]步骤S12：组织需要研磨处理，血液先通过Porteinase K溶液及缓冲液GB消化，使溶液体系澄清；
[0040]步骤S13：加入Tris饱和酚摇匀(10min)；
[0041]步骤S14：离心12000R，4度，7min，上层清液为DNA；
[0042]步骤S15：配置Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液(25：24：1)；
[0043]步骤S16：含上清液试管加入酚氯仿异戊醇溶液，离心，取上清，加入
‑
20过冻酒精，置于
‑
20冰箱过夜；
[0044]步骤S17：离心12000R，4度，7min；
[0045]步骤S18：弃上清，白沉淀即DNA；
[0046]步骤S19：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性，通过吸光度检测DNA的纯
度。
[0047]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0048]本专利技术采用DNA水平的KASP对S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于SNP技术检测河流型水牛β
‑
casein基因型的方法，原理来自KASP，主要步骤：步骤S1：提取样品DNA；步骤S2：电泳DNA，检测DNA的质量；步骤S3：制备PCR反应体系，体系内包括大于20％体积分数的DNA样品、1.4％体积分数的混合引物，以及余量的KASP混合液；步骤S4：进行PCR扩增；其中，步骤S3中添加的混合引物包括6种KASP引物，分别为β
‑
casein基因型SNP1的三种和SNP4的三种，即SNP1有一种未突变的基因型、两种突变基因型，SNP4有一种未突变的基因型、两种突变的基因型；突变基因引物及未突变基因引物中，一条带HEX荧光标签，另一条带FAM荧光标签,经过PCR扩增后，检测DNA样品的荧光强度，从而进行基因分型。2.如权利要求1所述的基于SNP技术检测河流型水牛β
‑
casein基因型的方法，主要步骤S3中，所添加的混合引物，主要用于分别检测四处突变位点的碱基类型，并且，针对不同的突变位点，设计的引物如下：(1)待检测β
‑
casein_80位点上的碱基类型时，引物序列：SNP1
‑
Primerl：gaaggtgaccaagttcatgctttgcagagctcagaagcgc；SNP1
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Primer2：gaaggtcggagtcaacggattttgcagagctcagaagcgt；SNP1
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PrimerCommon：aggcccagggcaagcaggag；(2)待检测β
‑
casein_55位点上的碱基类型时，引物序列：SNP4
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Primerl：gaaggtgaccaagttcatgctaggcccagggcaagcaggagg；SNP4
‑
Primer2：gaaggtcggagtcaacggattaggcccagggcaagcaggaga；SNP4
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PrimerCommon：ttgcagagctcagaagcg。3.如权利要求2所述的基于S...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞春英，梁莎莎，梁贤威，杨承剑，文崇利，唐振华，谢华德，李孟伟，郭艳霞，彭丽娟，彭开屏，冯玲，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：