一种检测藜麦茎腐病菌的引物组和试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及植物病原菌检测技术领域，提供了一种检测藜麦茎腐病菌的引物组和试剂盒及其检测方法。所述引物组包括上游检测引物JP1和下游检测引物JP2；所述上游检测引物JP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游检测引物JP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、检测准确度高的优点，可用于藜麦茎腐病菌(叶片，茎段和土壤中)的检测，对藜麦茎腐病菌病害的早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测藜麦茎腐病菌的引物组和试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及植物病原菌检测
，尤其涉及一种检测藜麦茎腐病菌的引物组和试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]黎麦起源于南美洲安第斯山脉，已有5000多年的栽培历史，又称藜谷、南美藜、昆诺阿藜等，整个生育期会受多种病虫害的侵染。目前报道的藜麦病害有分生孢子叶斑病、甲孢叶斑病或尾孢叶斑病、黑斑病、叶斑病、穗枯病、褐斑病、菌核病、叶霉病、霜霉病、黑茎病、病毒病、根腐病和炭疽病，其中茎腐病和叶斑病是中国藜麦危害最严重的病害。
[0003]黎麦茎腐病原菌主要侵染藜麦植株的茎杆和顶梢部分，症状初期为水浸状小斑点，环绕茎杆逐渐扩展，导致茎杆变褐色腐烂，形成软腐状。湿度大时，在茎杆上逐渐长出排列整齐、繁茂的真菌菌丝，顶部为黑色或深褐色的球状大型孢子囊和小型孢子囊。植株茎杆侵染后变褐色枯死并产生了大量的病菌孢子引起植株顶梢枯死。
[0004]藜麦叶斑病症状为圆形或近圆形斑点，直径1～4mm。斑点边缘为棕色，中心为黄色和白色，斑点上有小黑点，在疾病晚期有中央穿孔。主要的病原菌有藜钉孢，交链格孢菌、细极链格孢菌、芸薹链格孢菌，感病初期将会出现一些黄色或者斑点，后期逐渐变为一种褐色或深褐色螺纹状，严重时病斑中央将产生穿孔现象，病斑大小程度不一。
[0005]目前对植物真菌的检测有以下几种方法：采用半选择性培养基或液体培养基分离培养，但其结果易受其它杂菌的干扰，且需要进行再接种的生物学试验才能确定。幼苗生长法鉴定需要一个具有一定温湿度环境的温室，一个种子批至少种植10000株幼苗，如果有大量的样品需要鉴定时，工作量大，费时费力。最近发展起来的实时荧光PCR有较高的检测效率和灵敏度，但需要更昂贵的试剂和仪器，适合于相关的科学研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测藜麦茎腐病菌的引物组和试剂盒及其检测方法，具有灵敏度高、特异性强、检测准确度高的优点，可用于藜麦茎腐病菌(叶片，茎段和土壤中)的检测，对藜麦茎腐病菌病害的早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种检测藜麦茎腐病菌的引物组，包括上游检测引物JP1和下游检测引物JP2；所述上游检测引物JP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游检测引物JP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]JP1(SEQ ID NO:1)：5
’‑
GTTTTCCATAGAGTGGGTGT
‑3’
；
[0010]JP2(SEQ ID NO:2)：5
’‑
GAGTTTCCTCCGGCTTATTG
‑3’
。
[0011]本专利技术提供了一种检测藜麦茎腐病菌的试剂盒，包括检测引物JP1/JP2和检测试剂。
[0012]进一步地，检测试剂包括2
×
Pfu
‑
PCR MasterMIX，通用引物ITS1/ITS4，检测引物JP1/JP2和ddH2O。
[0013]本专利技术还提供了利用所述引物组检测藜麦茎腐病菌的方法，包括以下步骤：
[0014](1)提取样品的基因组DNA；
[0015](2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，利用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，获得扩增产物；
[0016](3)以步骤(2)中所述扩增产物为模板，利用所述检测引物进行第二轮PCR扩增，根据扩增结果判定样品中是否含有藜麦茎腐病菌，若扩增产物出现500bp大小的条带，则样品中存在藜麦茎腐病菌；否则，不存在。
[0017]进一步地，通用引物ITS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，通用引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018]ITS1(SEQ ID NO:3)：5
’‑
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
‑3’
；
[0019]ITS4(SEQ ID NO:4)：5
’‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3’
。
[0020]进一步地，步骤(2)中第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，变性、退火、延伸进行35个循环；72℃最终延伸5min。
[0021]进一步地，步骤(2)中第一轮PCR扩增的体系，以50μl计，包括以下组分：2
×
Pfu
‑
PCR MasterMIX 25μl，10μM的引物ITS1 2μl，10μM的引物ITS4 2μl，模板2μl，ddH2O 19μl。
[0022]进一步地，步骤(3)中第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸60s，变性、退火、延伸进行35个循环；72℃最终延伸5min。
[0023]进一步地，步骤(3)中第二轮PCR扩增的体系，以50μl计，包括以下组分：2
×
Pfu
‑
PCR MasterMIX 25μl，10μM的引物JP1 4μl，10μM的引物JP2 4μl，模板4μl，ddH2O 13μl。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0025](1)本专利技术利用真菌的通用引物ITS1和ITS4为引物，以藜麦茎腐病菌基因组DNA为模板，扩增出茎腐病DNA片段，然后通过藜麦上常见的几种真菌rDNA
‑
ITS区序列进行比对，根据序列差异，设计出对藜麦茎腐病菌基因组DNA有高度特异性的一对引物，对常见的几种藜麦病原真菌基因组DNA进行PCR扩增，只有以茎腐病病菌基因组DNA为模板的反应体系中能扩增出一条500bp左右的特异性条带，其余菌株DNA模板及清水对照均无扩增产物。并且利用特异性引物能从藜麦茎腐病菌叶片、茎段和土壤样品中扩增出特异性的条带。表明此特异性引物可以用于藜麦组织茎腐病菌的分子检测及病害的早期诊断。
[0026](2)本专利技术所述试剂盒检测灵敏度高，可以检测到50
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100fg/μL水平的茎腐病菌基因组DNA。
[0027](3)本专利技术所述检测引物特异性强，检测准确度高，可用于藜麦茎腐病菌(叶片，茎段和土壤中)的检测，对藜麦茎腐病菌病害的早期快速检测，土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。
附图说明
[0028]图1为茎腐病菌基因PCR电泳图；图中，泳道M：DNA Marker，标准分子量，DL
‑
2000；
[0029]图2为实施例2中检测引物PCR的特异性电泳图；图中，泳道CK：以双蒸水为模板；泳道1～2：以木霉基因组DNA为模板的两个重复样品；泳道3～4：以灰霉DNA为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测藜麦茎腐病菌的引物组，其特征在于，包括上游检测引物JP1和下游检测引物JP2；所述上游检测引物JP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游检测引物JP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种检测藜麦茎腐病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和检测试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括2
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Pfu
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PCRMasterMIX，通用引物ITS1/ITS4，检测引物JP1/JP2和ddH2O。4.一种利用权利要求1所述引物组检测藜麦茎腐病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，利用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，获得扩增产物；(3)以步骤(2)中所述扩增产物为模板，利用权利要求1中所述的检测引物进行第二轮PCR扩增，根据扩增结果判定样品中是否含有藜麦茎腐病菌，若扩增产物出现500bp大小的条带，则样品中存在藜麦茎腐病菌；否则，不存在。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟青，董杰，杨新建，田璐，邓志峰，句荣辉，
申请(专利权)人：北京农业职业学院，
类型：发明
国别省市：