一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌MTB39A(PPE18)蛋白抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒，该方法及试剂盒针对MTB39A(PPE18)蛋白抗体具有特异性强、灵敏度高、稳定性良好等优势。稳定性良好等优势。稳定性良好等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及抗体检测领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法，以及根据该检测方法制备的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病(tuberculosis，TB)的病原体，也是单一感染微生物导致死亡的最重要原因，是一类世界性的人兽共患传染病，一直受到国内外研究者的普遍关注。
[0003]该菌的致病物质主要是荚膜，脂质以及蛋白质；1999年，Corixa Corporation公司克隆了一个新基因—MTB 39A(PPE18)，该蛋白分子量为39kD，等电点为4.8088。免疫印迹分析证明MTB 39A(PPE18)在结核分枝杆菌的裂解物中，表明它不是分泌性抗原。纯化的重组MTB 39A(PPE18)在12名PPD(结核菌素)阳性个体中的9名外周血单核细胞中引发了强烈的T细胞增殖和γ干扰素反应。
[0004]目前多项研究均认为，MTB 39A(PPE18)蛋白可以提供对结核分枝杆菌的部分保护。这些结果可以进一步评估MTB 39A(PPE18)作为亚单位疫苗的组成部分，因此MTB 39A(PPE18)可以被用作结核分枝杆菌的诊断性生物标志物进行检测。
[0005]目前，对该蛋白的检测尚缺乏相关的检测产品，临床上亟需一种操作方便，敏感性高，特异性好，稳定可靠的方法进行养殖场动物及人类中结核分枝杆菌的流行病学调查和抗体水平的检测，因此，建立一种针对结核分枝杆菌MTB39A(PPE18)蛋白抗体的间接ELISA检测方法非常有必要。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，一方面本专利技术提供一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括MTB 39A(PPE18)蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液。
[0007]另一方面，本专利技术提供一种检测结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白抗体的方法，包括如下步骤：
[0008](1)抗原包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白；
[0009](2)洗涤液洗板，封闭；
[0010](3)洗涤液洗板，加入待测抗体或待测血清，以及阴性对照；
[0011](4)洗涤液洗板，加入酶标山羊抗兔IgG作为二抗；
[0012](5)洗涤液洗板，加入显色液；
[0013](6)加入终止液，测定OD450nm数值；
[0014](7)结果判断：当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。
[0015]本专利技术所提供的检测方法及检测试剂盒具有以下优点：
[0016]1、特异性强，利用本方法对实验室保留的结核分枝杆菌牛阳性血清及人阳性血清和采集的健康牛和人血清进行检测，结果显示，只有结核分枝杆菌阳性血清为阳性，而健康人或健康牛血清均为阴性，表明所建立的检测体系具有良好的特异性；
[0017]2、灵敏度高，将兔多克隆抗体按照倍比稀释，对建立并优化好的间接ELISA检测方法进行敏感性测试，实验结果显示在兔多克隆抗体稀释到1:32768时OD450为1.385，仍在阳性临界值0.282以上，说明建立并优化好的间接ELISA检测方法敏感性较高；
[0018]3、稳定性良好，利用建立好的间接ELISA检测方法，对结核分枝杆菌MTB 39A蛋白、抗体进行批次和批间检测，计算变异系数，验证该方法的稳定性，试验结果显示3次批内检测变异系数为1.01％
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2.38％，3次批间检测变异系数为1.10％
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1.82％，批间和批内重复的变异系数均小于5％，表明建立的该方法具有良好的稳定性。
附图说明
[0019]图1：结核分枝杆菌MTB 39A蛋白的表达、纯化及鉴定结果图；泳道1:1mM IPTG诱导表达后沉淀；泳道2：1mM IPTG诱导表达后上清；泳道3
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4：纯化后蛋白；泳道5
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6：包涵体蛋白粗制品；泳道7：包涵体蛋白粗制品上清。
[0020]图2：重组蛋白的SDS
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PAGE的His鉴定；泳道1:包涵体蛋白粗制品上清；泳道2：包涵体蛋白粗制品；泳道3
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6：纯化后蛋白；
[0021]图3：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与人阳性血清进行western blot鉴定；
[0022]图4：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与人阴性血清进行western blot鉴定；
[0023]图5：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与牛阳性血清进行western blot鉴定。
[0024]图6：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白与牛阴性血清进行western blot鉴定。
[0025]图7：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA反应条件的优化结果，其中7
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A为抗原包被浓度优化，7
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B为封闭时间优化，图7
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C为一抗稀释比例优化，7
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D为二抗稀释比例优化；
[0026]图8：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA临界值的确定。
[0027]图9：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白的兔多克隆抗体特异性试验结果。
[0028]图10：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA检测方法灵敏度试验结果。
[0029]图11：结核分枝杆菌MTB 39A(PPE18)蛋白兔多克隆抗体间接ELISA检测方法稳定性试验。
具体实施方式
[0030]一方面，本专利技术提供一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括MTB 39A(PPE18)蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液；
[0031]优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白具有SEQ ID NO:1所示的序列；
[0032]优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.25
‑
2.5μg/mL，例如0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，1.5μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL；优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.25
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1.5μg/mL；更优选地，所述MTB 39A(PPE18)蛋白包被浓度为0.5μg/mL；
[0033]优选地，所述酶标山羊抗兔IgG为HRP
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山羊抗兔IgG；
[0034]优选地，所述洗涤液为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括MTB 39A蛋白，酶标山羊抗兔IgG，洗涤液，包被液，封闭液，显色液和终止液；所述MTB 39A蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述MTB 39A蛋白包被浓度为0.25
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2.5μg/mL。3.根据权利要求1
‑
2任意一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标山羊抗兔IgG为HRP
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山羊抗兔IgG。4.根据权利要求3所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述HRP
‑
山羊抗兔IgG稀释比例为1:1000
‑
8000。5.根据权利要求1
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4所述任意一项的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST；所述包被液为Na2CO3/NaHCO3缓冲液；所述封闭液为BSA或脱脂奶粉。6.一种结核分枝杆菌MTB39A蛋白抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗原包被，所述包被抗原为重组结核分枝杆菌MTB 39A蛋白，其蛋白序列如SEQ ID NO:1所示；(2)洗涤液洗板，加入封闭液封闭；(3)洗涤液洗板，加入待测抗体或待测血清，以及阴性对照；(4)洗涤液洗板，加入酶标山羊抗兔IgG作为二抗；(5)洗涤液洗板，加入显色液；(6)加入终止液，测定OD450nm数值；(7)结果判断：当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。7.根据权利要求6所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤(1)抗原包被是以包被液稀释包被抗原至0.25
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2.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，所述包被液为0.85M Na2CO3/NaHCO3缓冲液，pH值为9.6；步骤(2)所述封闭液为5％BSA；封闭孵育时间为30

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，王玉炯，蔡玉荣，王璞，曾瑾，张思浓，王盛，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：