一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，该方法包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。本发明专利技术的肿瘤类器官药物敏感性检测方法是基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。相较于PDX建模后进行药敏检测的方法，本发明专利技术的方法通量更高，时间更短。相较于ATP法类器官药敏，本发明专利技术直接对细胞活率进行检测，而不是检测ATP，能够更准确的评估药物接触后细胞活性，判断药物敏感性。判断药物敏感性。判断药物敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法


[0001]本专利技术涉及药物敏感性检测
，具体涉及一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法。

技术介绍

[0002]近年肿瘤靶向药加速研发上市，但靶向药抗肿瘤机制极其复杂，患者个体差异很大，面对大量的抗肿瘤新药，如何选择用药方案成为新的挑战，许多在我国高发但欧美发病率较低的恶性肿瘤，如肝癌、鼻咽癌、胃癌、食管癌等，缺乏临床数据，临床用药盲目性随意性极大，疗效差，费用高，距离真正意义上的精准个体化治疗还很遥远。肿瘤药物敏感性检测技术，正是提高肿瘤研究与精准治疗效率的有效方法。不但能在最大程度上模拟人体内肿瘤微环境，还可以保持肿瘤的异质性，更加客观准确的反应药物疗效和安全性。
[0003]类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2D细胞系、PDX模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
[0004]肿瘤类器官药物敏感性检测，是通过采集患者手术、穿刺或恶性积液等活性肿瘤样本，体外进行要类器官培养后，进行药物敏感性检测。现有肿瘤类器官药物敏感性检测技术，多采用ATP发光法检测药物处理后类器官细胞中的ATP量，间接反应细胞的活力，因而当样本含有较多非肿瘤细胞时，如淋巴细胞等，会受到非肿瘤细胞的干扰，影响最终结果。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法。本专利技术的技术方案为：
[0006]一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。
[0007]进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：
[0008]步骤1，将获得的癌症组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
[0009]步骤2，将肿瘤类器官与基质胶等量混匀后，传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4
‑
14天；
[0010]步骤3，采用细胞荧光染色剂对所有组别的肿瘤类器官进行染色，染色完成后，置
换染液为药敏培养基并于37℃放置一段时间，之后重复多次更换药敏培养基并放置的过程，直到洗去多余的染料；
[0011]步骤4，将所有组别的肿瘤类器官的药敏培养基移除，加入细胞消化液将肿瘤类器官消化为单细胞；
[0012]步骤5，测试每个组别的单细胞活性，并根据活性检测结果分析评估药物敏感性。
[0013]进一步地，所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，1
‑5×
；N
‑
acetylcysteine，1
‑
10mM；L
‑
WRN细胞上清液，5％～30％；IGF，50
‑
500ng/ml；EGF，10
‑
100ng/ml；Y27632，1
‑
10uM；8
‑
bromo
‑
cAMP，10
‑
100nM；Primocin，50
‑
250ug/ml；硫酸庆大霉素，10
‑
100μg/mL；以上成分溶于基础培养基，前述的百分浓度表示体积浓度。
[0014]进一步地，所述药敏培养基还包括：CHIR99021，1
‑
10uM；gastrin I，1
‑
10nM。
[0015]可选地，所述基础培养基为advanced DMEM/F12、DMEM、F12、DMEM/F12中的一种。
[0016]进一步地，所述步骤3中染色过程的控制参数为：37℃染色不低于60min。
[0017]进一步地，所述细胞荧光染色剂：Hoechst 33342、Calcein Am(钙黄绿素
‑
AM)、PI(碘化丙啶)、DAPI中的至少两种。
[0018]前述的几种荧光染色剂中，Hoechst 33342显示蓝色荧光，用来标记活细胞；Calcein Am(钙黄绿素
‑
AM)显示绿色荧光，用来标记活细胞；PI(碘化丙啶)显示红色荧光，用来标记死细胞；DAPI显示蓝色荧光，用来标记细胞核。
[0019]进一步地，所述步骤5中测试每个组别的单细胞活性是采用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计每个组别的单细胞各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算得到细胞活率，细胞活率＝活细胞染色面积/(活细胞染色面积+死细胞染色面积)。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术的肿瘤类器官药物敏感性检测方法是基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。相较于PDX建模后进行药敏检测的方法，本专利技术的方法通量更高，时间更短。相较于ATP法测试的类器官药敏性，本专利技术直接对细胞活率进行检测，而不是检测ATP，能够更准确的评估药物接触类器官后的细胞活性，判断药物敏感性。此外，本专利技术的检测方法可以采用加药前后自身对照，减少阴性对照孔，节约类器官，提高筛药通量。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1的肠癌类器官Calcein Am荧光染色结果图。
[0023]图2为本专利技术实施例1的荧光染色法与对比例1的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
[0024]图3为本专利技术实施例2的荧光染色法与对比例2的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
[0025]图4为本专利技术实施例3的荧光染色法与对比例3的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
[0026]图5为本专利技术实施例4的荧光染色法与对比例4的ATP法肿瘤药物敏感性检测对比。
[0027]图6为本专利技术实施例5在不同细胞量梯度下药敏结果的变化情况。
具体实施方式
[0028]在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0029]下面结合附图和具体的实施例对本专利技术做进一步详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。
[0030]实施例1<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。2.根据权利要求1所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述检测方法具体包括以下步骤：步骤1，将获得的癌症组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；步骤2，将肿瘤类器官与基质胶等量混匀后，传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4
‑
14天；步骤3，采用细胞荧光染色剂对所有组别的肿瘤类器官进行染色，染色完成后，置换染液为药敏培养基并于37℃放置一段时间，之后重复多次更换药敏培养基并放置的过程，直到洗去多余的染料；步骤4，将所有组别的肿瘤类器官的药敏培养基移除，加入细胞消化液将肿瘤类器官消化为单细胞；步骤5，测试每个组别的单细胞活性，并根据活性检测结果分析评估药物敏感性。3.根据权利要求1或2所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，1
‑5×
；N
‑
acetylcysteine，1
‑
10mM；L
‑
WRN细胞上清液，5％～30％；IGF，50
‑
500ng/ml；EGF，10
‑
100ng/ml；Y27632，1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丛，朱宇，陈泽新，黄敏，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：