用于大量产生植物外排体的方法技术

本发明专利技术涉及大量产生植物外排体的方法。本发明专利技术的方法可以通过使用可同时处理大量植物原材料的离心和TFF从大量植物原料提取高纯度植物外排体。本发明专利技术通过改进停留在实验室水平的常规植物外排体提取方法而提出了易于大量产生的方法。产生的方法。产生的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于大量产生植物外排体的方法


[0001]本申请要求基于2019年7月2日提交的韩国申请号10
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2019
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0079490的优先权，并且在相应申请的说明书和附图中公开的所有内容通过引用并入本文。
[0002]本公开内容涉及用于从植物原料包括具有坚硬果肉或果皮的植物分离外排体的方法。更具体地，本公开内容涉及用于从植物原料大规模产生高纯度植物外排体以便有用地用于相关行业例如药物和商业化产品等的方法。

技术介绍

[0003]据报道，外排体是由多种细胞分泌的纳米大小的微泡，并且含有蛋白质、脂质、mRNA和miRNA，并且通过作用于内分泌系统而充当细胞间通讯的重要介质。这种作用作为可克服常规干细胞治疗剂的问题，例如移植率和免疫原性的新治疗剂而引起人们的注意。
[0004]根据最近的研究，从可食用植物分离的外排体与从哺乳动物细胞分泌的外排体相比没有毒性或免疫原性，并且已知具有非常高的体内稳定性和生物相容性。此外，据报道从哺乳动物细胞分离的外排体含有约20％的胆固醇，但可食用植物外排体不含胆固醇。特别地，与动物组织或细胞培养溶液相比，植物原料具有可大量获得的优点。
[0005]根据来源的植物，外排体中包含多种植物，但是直到现在，关于与植物外排体相关的蛋白质知之甚少，并且与哺乳动物细胞的外排体相比，在确定特征方面存在限制。在大多数研究中，植物外排体的特征通过外排体的大小或形状来确定，并且为了分离植物外排体，需要用于选择适当大小并仅分离外排体的方法。
[0006]在现有技术的情况下，已经尝试通过使用蔗糖梯度的密度梯度超速离心法来分离植物外排体，但是该方法难以用于外排体商业化的生产过程中。此外，有一种方法是通过过滤分离的胞外囊泡来获得尺寸小于过滤过滤器孔的物质，即当从大量植物汁液中分离外排体时，由于杂质或外排体被吸附并积聚在过滤器孔中，过滤效率迅速降低，这对于长期外排体分离非常不利。
[0007]在整个说明书中引用了许多文献，并指出了其引用。所引用的文献的公开内容通过引用整体并入本文以更清楚地说明本公开内容和本公开内容所属领域的水平。
[0008]技术问题
[0009]在本公开内容中，建议使用离心和TFF的大规模产生方法作为用于分离高纯度植物外排体的方法。通过本公开内容，高纯度植物外排体的纯化和生产率得到有效提高。
[0010]因此，本公开内容的一个目的是提供能够大规模有效分离高纯度植物外排体的方法，补充了常规分离方法。
[0011]本公开内容的另一个目的是提供用于从植物原料中大规模分离具有均匀粒径和分布的高纯度外排体的方法。
[0012]本公开内容的另一个目的是提供用于分离植物外排体的方法，所述方法不限于植物原料包括海洋植物群例如硬皮、茎、种子和海芥菜、紫菜等，不同于现有技术中限于软肉或汁液的方法。
[0013]本公开内容的另一个目的是提供用于分离植物来源外排体的方法，其适合于医疗和商业产品的GMP生产并且有助于过程放大(scale
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up)。
[0014]本公开内容的其他目的和益处将通过以下本专利技术详细描述、所附权利要求书和附图而变得更加明显。
[0015]技术方案
[0016]本公开内容的一个方面是提供用于分离植物外排体的方法，其包括进行离心；以及进行切向流过滤(tangential
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flow filtration，TFF)作为超滤。
[0017]本文中使用的术语“植物外排体”是指从植物分离的大小为约50至200nm的外排体或外排体样胞外囊泡。
[0018]已知植物来源外排体与从哺乳动物细胞分泌的外排体相比具有低毒性和免疫原性，并且具有非常低的胆固醇含量，因此它们的稳定性和生物相容性非常高。此外，已知植物来源外排体由于植物来源抗氧化剂组分或蛋白质组分而在伤口愈合和皮肤再生方面有效。
[0019]同时，作为用于从活生物体分离外排体的多种方法，已经开发了离心、超速离心、密度梯度离心、色谱法、过滤、超滤、切向流过滤、基于聚合物的沉淀、总外排体提取试剂盒和免疫亲和分离方法等。然而，在该现有技术的情况下，外排体分离方法限于从动物，有限地，哺乳动物来源的细胞或生物溶液(例如牛奶)中分离外排体的方法。由于在与动物来源细胞不同的植物来源细胞中发现了与外排体相似的液泡，因此已经引入了用于去除它们的方法，但是大多数限于实验室水平的剂量。
[0020]在本公开内容中，通过将常规已知的外排体分离方法中的超速离心和作为超滤的切向流过滤特别地组合，提供了用于分离植物来源外排体的方法，其可以防止杂质例如液泡的污染和纯度的劣化并且大规模地获得高纯度植物外排体。除了所述组合之外，通过先前已知的外排体分离方法中任何其他两种方法的组合都难以获得从中去除了液泡的植物外排体，并且特别是不可能大规模均一地获得高纯度植物外排体。
[0021]植物来源外排体可具有30至500nm的均匀尺寸分布，优选地，其可具有50至200nm的均匀尺寸分布。
[0022]在另一方面，为了替代限于小量产生植物外排体的常规密度梯度离心方法，提供了使用离心和TFF方法的大规模产生植物外排体的方法。
[0023]本公开内容中使用的离心是使用固体与固体周围的液体之间的密度差的分离方法，并且是指使用离心力加速固体沉降的方法。离心具有能够连续重复该过程、在短时间内处理大量以及允许在无菌状态下容易操作的优点。本公开内容的离心可以是差速离心、密度梯度离心或其组合，但不限于此。
[0024]本公开内容中使用的离心方法可选自低速离心、高速离心、超速离心及其组合，并且优选地，其可包括超速离心。低速离心可达到6,000rpm(6,000xg)或更低的速度，并且主要用于容易沉淀的样品例如细胞或细胞核的离心，并且高速离心具有约20,000至25,000rpm(60,000xg)的最大速度，并且超速离心是指具有约40,000至80,000rpm(600,000xg)的最大速度的离心方法。
[0025]先前，已知超速离心在分离过程中具有低产率并且破坏外排体，因此它不能用于外排体的大量分离，并且仅可以是实验室级别的分离。然而，本专利技术人出人意料地发现，与
动物外排体不同，植物外排体可通过超速离心有效地提高生产力而不损伤外排体，并且可应用于外排体大量产生过程。在一个实施方案中，本公开内容的离心可以通过包括以下来进行：(a)在以1,000至3,000xg的速度的离心条件下离心10至30分钟之后获得上清液的过程，(b)在以10,000至50,000xg的速度的超速离心条件下通过超速离心60分钟至2小时去除液泡的过程，和(c)在以100,000至150,000xg的速度的超速离心条件下通过超速离心60分钟至2小时获得包含外排体的沉淀物的过程。
[0026]此外，本公开内容的方法的特征在于其包括进行切向流过滤(TFF)。本公开内容中使用的切向流过滤(TFF)是这样的过滤方法，其中溶液沿与过滤膜垂直的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于分离植物外排体的方法，其包括：进行离心；以及进行切向流过滤(TFF)。2.根据权利要求1所述的用于分离植物外排体的方法，其中所述离心包括超速离心。3.根据前述权利要求中任一项所述的用于分离植物外排体的方法，其中所述切向流过滤是选自以下的一种或更多种：中空纤维TFF和膜TFF。4.根据前述权利要求中任一项所述的用于分离植物外排体的方法，其中所述切向流过滤使用截止分子量(MWCO)为100,000Da至500,000Da的TFF过滤器。5.根据前述权利要求中任一项所述的用于分离植物外排体的方法，其中所述方法还包括在所述离心之前将植物原料压碎。6.根据前述权利要求中任一项所述的用于分离植物外排体的方法，其中所述植物原料包括选自以...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵容佑，崔志淑，崔荣赞，金民康，
申请(专利权)人：胞外体干细胞株式会社，
类型：发明
国别省市：