一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；其中抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液；VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得；吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐或其他吖啶酯衍生物，抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。本发明专利技术选择吖啶酯修饰物与人源化抗VEGF抗体Fab段偶联，稳定性高，提升了检测系统的灵敏度、检测范围以及保存时间并缩短了反应时间。本试剂盒线性范围达到0.5～50000pg/mL。性范围达到0.5～50000pg/mL。性范围达到0.5～50000pg/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用


[0001]本专利技术属于血管内皮生长因子检测
，具体为一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用。

技术介绍

[0002]血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是胚胎发生、骨骼生长和生殖功能过程中生理性血管生成的关键调节剂。研究发现VEGF在多种病理和生理条件下表达，因此可以作为标志物用于体外诊断。目前市面上VEGF体外检测试剂盒主要采用的是量子点免疫荧光法，酶联法，板式化学发光法和磁微粒化学发光法。目前现有试剂盒存在着下列问题：
[0003]1)灵敏度和线性范围还需进一步提升。有报道称健康志愿者的VEGF含量为16.27
±
8.54pg/ml，而胃癌早期患者的VEGF含量均值为223.61
±
58.67pg/ml，而处于肝癌早期组的血清中VEGF含量均值也仅为549.7
±
150.1pg/ml。如试剂盒的灵敏度不高，则不能很好地起到早期筛查的作用。与此同时，现有产品中，灵敏度最高的产品为0.1pg/ml，但是其线性范围上限仅为800pg/ml。而IIIA/IIIB期的肿瘤患者血清VEGF浓度范围为14.9
‑
1824.0pg/mL，这将导致在实际检测时不得不对高VEGF浓度样品进行稀释，而增加的额外步骤将会降低数据的可重复性和真实性。而检测线性范围相对较大的产品其灵敏度不足(普遍大于1pg/ml)，这也可能导致检测数据准确性的下降而影响临床判断。
[0004]2)工艺复杂。目前VEGF磁微粒化学发光检测试剂盒主要的工艺路线有两种。一种工艺是抗体和磁珠之间引入一对连接物来起到信号放大的作用；另一种方式是抗体直接包被在活化后的磁珠上。而这两种工艺都较为复杂，不利于试剂盒的大批量稳定生产。
[0005]3)检测时间较长。目前市面的VEGF试剂盒主要的检测方式为一步法和两步法。两步法指的是先将待测抗原与包被抗体结合，冲洗后再加入标记抗体孵育，彻底洗涤未结合的标记抗体后进行显色。一步法指的是将待测抗原、包被抗体与标记抗体一并孵育，彻底洗涤后进行显色。相比较两步法，一步法所需孵育总时长更短，普遍在25分钟左右，而目前的一步法所需孵育总时长仍然是较长的，无法在临床更快速地辅助医生给出疾病控制的方案。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的问题，本专利技术提出了一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用。本专利技术的目的是这样实现的：
[0007]一种试剂盒，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；所述抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液，其中磁珠与抗体A的质量比为：50:1～150:1；所述VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得，其中抗体B与吖啶酯修饰物的物质的量的比为1:5～1:20；
[0008]所述吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐(NSP
‑
SA
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NHS，Cas：199293
‑
83
‑
9)或其他吖啶酯衍生物；所述抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。
[0009]进一步的对磁珠的优化，所述抗体包被磁珠工作液中的磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠。
[0010]进一步的对抗体的优化，所述为抗体A和抗体B分别为rVEGF
‑
Fab 1与rVEGF
‑
Fab 2中的各一种，rVEGF
‑
Fab 1和rVEGF
‑
Fab 2均由轻链和重链组成；rVEGF
‑
Fab 1轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，rVEGF
‑
Fab 1重链的氨基酸序列如序列表中序列2所示；rVEGF
‑
Fab 2轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示，rVEGF
‑
Fab2重链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0011]进一步的，所述抗体包被磁珠工作液的制备方法：取磁珠母液重悬后加入硼酸盐缓冲液进行抗体A的包被；然后加入缓冲液TBS
‑
T(20
‑
200mM Tris，0
‑
1M NaCl，0.0％
‑
1％BSA，0.1％
‑
0.5％Tween
‑
20，0.1％
‑
1％Proclin
‑
300，pH 6.5
‑
9.0)稀释至工作需要浓度。
[0012]进一步的，所述VEGF标记抗体的制备方法为：取抗体B用CBS缓冲液稀释，加入吖啶酯修饰物溶液，搅拌均匀后经过反应得到半成品标记物，加入DL
‑
赖氨酸后使用Sephadex G
‑
25脱盐获得VEGF标记抗体，洗脱缓冲体系为TBS
‑
T(20
‑
200mM Tris，0
‑
1M NaCl，0.0％
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1％BSA，0.1％
‑
0.5％Tween
‑
20，0.1％
‑
1％Proclin
‑
300，pH 6.5
‑
9.0)。
[0013]进一步的，所述VEGF校准品和所述VEGF质控品均由样品稀释液配制而成，所述VEGF校准品的浓度范围为0.5
‑
50000pg/mL，所述VEGF质控品的浓度为200pg/ml，400pg/ml和4000pg/ml。
[0014]进一步的，所述样品稀释液为pH 6.5
‑
9.0的PBS缓冲液，且每升样品稀释液还含有5
‑
20g BSA和1
‑
10ml Proclin
‑
300。
[0015]进一步的，该试剂盒中含有独立保存的浓缩洗涤液及两种不同的发光激发液。
[0016]所述的试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。
[0017]应用过程中的一种检测方法为：以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，在反应杯中依次加入用样品稀释液稀释后的样品、抗体包被磁珠工作液和VEGF标记抗体，33
‑
40℃孵育10～20min后进行磁分离，使用稀释后的浓缩洗涤液清洗数次，将反应杯送入暗室，加入发光激发液A与发光激发液B进行发光反应，并记录发光值。通过VEGF校准品校准、并且通过VEGF质控品进行质控。
[0018]本专利技术的优点和有益效果是：
[0019]1、本专利技术选择吖啶酯修饰物与人源化抗VEGF抗体Fab段偶联，稳定性高，提升了检测系统的灵敏度、检测范围以及保存时间并缩短了反应时间。本试剂盒线性范围达到0.5～50000pg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；所述抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液，其中磁珠与抗体A的质量比为：50:1～150:1；所述VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得，其中抗体B与吖啶酯修饰物的物质的量的比为1:5～1:20；所述吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐或其他吖啶酯衍生物；所述抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗体包被磁珠工作液中的磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述为抗体A和抗体B分别为rVEGF
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Fab 1与rVEGF
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Fab 2中的各一种，rVEGF
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Fab 1与rVEGF
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Fab 2均由轻链和重链组成；rVEGF
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Fab 1轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，rVEGF
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Fab 1重链的氨基酸序列如序列表中序列2所示；rVEGF
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Fab 2轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示，rVEGF
‑
Fab2重链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹检平，赵立哲，陈卓，
申请(专利权)人：北京健平金星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：