快速检测GI群诺如病毒的ERA方法、组合物和试剂盒技术

本发明专利技术涉及GI群诺如病毒的酶促重组等温扩增技术（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）基础型和荧光型两种快速检测方法。本发明专利技术还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物和探针组合物。本发明专利技术还涉及包含所述组合物的ERA检测试剂盒。使用本发明专利技术的组合物进行基础型或荧光型ERA检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测食品和粪便等样本中的GI群诺如病毒成分。群诺如病毒成分。

【技术实现步骤摘要】
快速检测GI群诺如病毒的ERA方法、组合物和试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于GI群诺如病毒的基础型和荧光型ERA快速检测技术，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。
[0002]
技术介绍

[0003]诺如病毒，又称诺瓦克病毒（Norwalk Viruses, NOV），是人类杯状病毒科（Human Calicivirus, HuCV）中诺如病毒（Norovirus, NOV）属的一种无包膜单股正链的 RNA 病毒。NOV多以食物和水为载体，可以造成多种哺乳性动物以呕吐、腹泻为主的病毒性肠胃炎，是目前常见的食源性病毒之一。由 NOV 引发的感染性腹泻在世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要为成人和学龄儿童，其中每年10月至次年3月是高发期。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60%
‑
90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒感染发病率约15%左右。
[0004]诺如病毒基因组全长7.65 kb，主要有三个开放读码框（Open Reading Frame, ORF），即ORF1、ORF2、ORF3，分别编码与病毒复制相关的非结构蛋白、VP1结构蛋白和VP2结构蛋白。根据完整的VP1基因氨基酸多样性和ORF1上编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）区域的核苷酸多样性，可以将诺如病毒分为5个不同的基因群（GⅠ～G
Ⅴ
）。其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人。其中GI型基因群又包括9个基因亚型，分别命名为GⅠ.1
‑
GⅠ.9，代表株为Norwalk virus，包括Southampton virus.Desert shield virus等。我国目前最常见的诺如病毒感染主要为GⅠ群和GⅡ群，每年 NOV 的爆发都会对国家造成很大的医疗及经济负担，但是由于 NOV 的自身特性，无法在体外进行增值培养，导致目前为止没有特效的疫苗和药物，所以如何高效快速的检测 NOV成为了现代研究者迫切需要解决的问题。
[0005]生物体的遗传物质主要由核酸决定，随着分子生物学技术的快速发展，通过鉴别核酸来溯源生物成分的各种分子生物学技术具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点，在食源性致病微生物检测中的应用越来越广泛。并且对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用分子生物学的方法才能得到可靠结果。然而目前广泛流行的PCR核酸扩增技术已经无法满足快速检测的需要，因为这些PCR技术通常检测时间在2 h以上，并且需要配备专业的PCR核酸扩增仪，这些都限制了PCR核酸扩增技术的推广应用，因此，需要一种能够快速高效步骤简单的核酸检测方式，而酶促重组等温扩增技术（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）符合这种要求。该技术原理是：在常温的环境下，重组酶与引物紧密结合，形成重组酶和引物的聚合体。当重组酶和引物聚合体在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构。然后，在DNA聚合酶的作用下，引物沿5
’→3’
方向延伸，形成新的DNA互补链，并完成扩增产物的指数级增长。因此在37～40℃的反应条件下即可对微量的DNA、RNA特异片段进行高效快速扩增，几分钟之内可以扩增数十亿倍。其低温适应性和灵敏度等方面取得了重
大突破并达到国际先进水平。并且该技术是我国研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，可以摆脱国外专利壁垒。该技术方便、准确、迅速，已成为近年来研究的热点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于快速高效、简单直观、准确灵敏的检测食品、粪便等样本中GI诺如病毒成分，本方法对于GI诺如病毒现场快速筛查和风险检测具有重要意义，能有效防止诺如病毒感染的发病率。
[0007]本专利技术的专利技术人根据国际标准ISO TS 15216
‑2‑
2013、国标GB 4789.42
‑
2016中GI群诺如病毒的参考基因——诺瓦克病毒（Norwalk
ꢁ
virus）（GenBank: M87661.2）为设计引物和探针的靶序列，同时检索了NCBI数据库中常见的肠道病毒全基因组序列，如轮状病毒、甲肝病毒、腺病毒等。利用Clustal X软件对常见进行序列比对，根据ERA引物设计原理，在种间差异区域设计和筛选了能够高效检测GI群诺如病毒的特异性ERA引物和探针。同时建立了基础型和荧光型ERA两种GI群诺如病毒现场快速检测技术。
[0008]在本专利技术的一个方面，提供了基础型ERA检测GⅠ群诺如病毒的寡核苷酸引物上游G
Ⅰꢀ
F：5
’‑ꢀ
ATGTATGTCCCAGGATGGCAGGCCATGT
ꢀ‑3’
（SEQ ID No.1），和下游G
Ⅰꢀ
R：5
’‑ꢀ
TCCGGTACCAACTGACCAGCGCCACTAG
ꢀ‑3’
（SEQ ID No.2）。该引物可特异性识别GⅠ群诺如病毒序列，扩增片段长度168 bp，扩增条件为：37℃ 扩增10 min。
[0009]在本专利技术的另一个方面，提供了荧光型ERA检测GⅠ群诺如病毒的探针GⅠP：5
’‑ꢀ
GACCTCGGATTGTGGACAGGAGATCGCGATCTTCTGCCCGAATTCGT
‑3’
（SEQ ID No.3），在探针的3
’
端碱基用c3
‑
spacer封闭，在第30位的T碱基上修饰FAM荧光报告基团，第31位的C碱基用四氢呋喃（THF）代替，第32位的T碱基上修饰淬灭基团BHQ1。该探针与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组合进行荧光型ERA扩增，从而特异性识别GⅠ群诺如病毒。在qPCR仪中设置反应程序为：37 ℃ 1 s；37 ℃ 5 s，40个循环；在第二反应阶段收集FAM荧光信号。
[0010]在本专利技术的再一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。所述组合物包含选自以下（1）至（2）中的任意一组或多组引物和探针序列：（1）GⅠ群诺如病毒基础型ERA检测寡核苷酸引物对SEQ ID No.1~SEQ ID No.2；（2）GⅠ群诺如病毒荧光型ERA检测寡核苷酸引物对SEQ ID No.1~SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3序列；在一个实施方式中，GⅠ群诺如病毒基础型ERA扩增条件是37 ℃ 10 min，反应结束后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）试剂，振荡混匀后充分离心，上层溶液用2％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
[0011]在一个实施方式中，GⅠ群诺如病毒荧光型ERA扩增条件是37 ℃ 1 s；37 ℃ 5 s，40个循环；在第二反应阶段收集FAM荧光信号。通过荧光曲线分析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通过基础型ERA法检测GI群诺如病毒的组合物，所述组合物包含GI群诺如病毒特异性寡核苷酸引物对：5
’‑
ATGTATGTCCCAGGATGGCAGGCCATGT
‑3’
，和5
’‑
TCCGGTACCAACTGACCAGCGCCACTAG
ꢀ‑3’
。2.通过荧光型ERA法检测GI群诺如病毒的组合物，所述组合物包含权利要求1所述的GI群诺如病毒特异性寡核苷酸引物对，以及探针5
’‑ꢀ
GACCTCGGATTGTGGACAGGAGATCGCGATCTTCTGCCCGAATTCGT
‑3’
，其中在探针的3
’

【专利技术属性】
技术研发人员：袁飞，杨艳歌，吴占文，李红娜，李涛，王迎春，王帅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：