本发明专利技术公开了一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法，涉及基因工程技术领域。纤维素酶核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术得到一种在肠胃环境温度下，具有更高酶催化活性的单体纤维素酶。构建的酶为一种新型的，能在肠胃环境温度下高效促进中药纤维素的溶解，进而促进有效成分快速释放的纤维素酶。效成分快速释放的纤维素酶。
【技术实现步骤摘要】
一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法
[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法。
技术介绍
[0002]中药发酵饲料在中国具有巨大的优势。中药安全、无毒、靶点多，作为饲料添加剂具有广阔的前景。
[0003]中药发酵能提升中药有效成分的溶出效率，提高药效，改善口感，菌酶中药的协同作用，能更好的提高动物的免疫力和营养的吸收效率。
[0004]中药发酵时，往往需要纤维素酶。已有的纤维素酶的最适酶活在50℃左右。在中药发酵的时候，温度一般在37℃左右，现有的纤维素外切酶都不太适宜于中药的发酵。
[0005]在动物的胃肠道中，消化环境的温度一般为37℃左右。纤维素酶在体内降解植物内纤维组分，要求在37℃左右有较高的酶活性。
[0006]因此，如何提供一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶，编码酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]优选的：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]本专利技术还提供了一种上述的适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法，其步骤为：
[0012](1)以核苷酸序列如SEQ ID NO.1的合成序列为模板进行易错PCR扩增；
[0013](2)利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对扩增产物进行双酶切，并回收基因片段；
[0014](3)利用与步骤(2)中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pRSFduet
‑
1；
[0015](4)将步骤(2)中回收的基因片段与步骤(3)中双酶切后的载体连接，获得重组表达载体pRSFduet
‑1‑
SQ，再转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，提取表达载体质粒、鉴定并依次对转化菌株编号；
[0016](5)转化菌株经蛋白表达、纯化、酶活性分析筛选目标纤维素酶。
[0017]优选的：步骤(1)所述易错PCR的反应体系：易错PCR Mix 3.0μL，易错PCR dNTP 3.0μL，5mM MnCl23.0μL，10μg/μL DNA模板1μL，10μM PCR引物2μL，Taq DNA聚合酶1μL，灭菌双蒸水17μL；程序：前变性95℃3min；变性94℃1min；退火45℃1min；延伸72℃4min；32个循环后，72℃延伸10min。
[0018]优选的：步骤(2)、(3)上酶切体系：超纯水11μL，BamHI 1μL，EcoRI1μL，Buffer 3μL，目的基因14μL。
[0019]本专利技术还提供了上述的一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶在发酵中的应用。
[0020]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法，取得的技术效果为本专利技术得到一种在肠胃环境温度下，具有更高酶催化活性的单体纤维素酶。构建的酶为一种新型的，能在肠胃环境温度下高效促进中药纤维素的溶解，进而促进有效成分快速释放的纤维素酶。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]本专利技术实施例公开了一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法。
[0023]实施例中涉及的生物试剂均为市售取得获得，例如：
[0024]E.coli DH5а，市售途径采购，实验室保藏；限制性内切酶，TakaRa公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；即用型易错PCR试剂盒，北京天恩泽科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，福州奥研实验器材有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；质粒pRSFduet
‑
1购自科雷生物科技有限公司；序列SQ2
‑
1基因全合成，擎科生物有限公司合成；
[0025]Primer F:GGATCCATGAAACGTAACCTGTT；
[0026]PrimerR:GAATTC TTAATGGTGGTGGTGGT，擎科生物有限公司合成；
[0027]蛋白表达和纯化过程中用到的培养基和缓冲液：
[0028]LB培养基：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉：
[0029]洗涤缓冲液：10mM咪唑，50mM K2HPO4‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0：
[0030]洗脱缓冲液：200mM咪唑，50mM K2HPO4‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0：
[0031]保存缓冲液：50mM K2HPO4‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。
[0032]实施例1
[0033]易错PCR
[0034]以合成的引物Primer F和Primer R为引物，以合成的序列SQ1
‑
1(GGATCCATGAAACGTAACCTGTTCCGCATCGTTTCTCGTGTTGTACTGATTGCTTTCATCGCATCCATCTCTCTGGTGGGTGCTATGAGCTATTTCCCGGTAGAAACCCAGGCGGCCCCGGATTGGTCTATTCCGTCCCTGTGCGAATCTTATAAAGATGACTTTATGATCGGTGTTGCGATCCCTGCCCGTTGTCTGAGCAACGATACCGACAAACGCATGGTTCTGAAACATTTCAACTCTATCACCGCCGAAAACGAAATGAAGCCAGAAAGCCTGCTGGCCGGTCAGACTAGCACCGGCCTGTCTTACCGCTTTTCCACTGCAGACGCTTTTGTGGATTTCGCGAGCACTAACAAAATTGGCATCCGCGGCCATACCCTGGTTTGGCACAACCAGACCCCGGATTGGTTCTTCAAAGATTCTAACGGTCAGCGTCTGTCCAAGGACGCACTGCTGGCTCGTCTGAAACAGTACATCTATGATGTTGTGGGCCGTTACAAGGGCAAAGTGTATGCGTGGGATGTAGTGAACGAGGCAATCGACGAAAACCAACCGGACAGCTACCGTCGCTCTACCTGGTACGAGATCTGTGGTCCGGAATACATTGAGAAAGCCTTCATCTGGGCCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶，其特征在于，编码酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种权利要求1或2所述的适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法，其特征在于，其步骤为：(1)以核苷酸序列如SEQ ID NO.1的合成序列为模板进行易错PCR扩增；(2)利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对扩增产物进行双酶切，并回收基因片段；(3)利用与步骤(2)中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pRSFduet
‑
1；(4)将步骤(2)中回收的基因片段与步骤(3)中双酶切后的载体连接，获得重组表达载体pRSFduet
‑1‑
SQ，再转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，提取表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：游锡火，王玉万，薛栋升，蒋慧，梁大明，田美华，胡燕，夏胜，王伟，任雅楠，于晶晶，刘佳丽，孙赫，孙哲，刘艳辉，曾徐浩，张耀，齐义清，沈力，游王丹，
申请(专利权)人：中农华威生物制药湖北有限公司，
类型：发明
国别省市：
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