一种抗癌脂肽的制备及其在抗肿瘤治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗癌脂肽C8H

【技术实现步骤摘要】
一种抗癌脂肽的制备及其在抗肿瘤治疗中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人工合成的具有优异体内外抗癌活性的抗癌脂肽的制备及其在抗肿瘤治疗中的应用。

技术介绍

[0002]尽管癌症的治疗取得了长足的发展，但它仍然是造成人类死亡最严重的疾病之一。目前主要通过化疗和放疗治疗癌症，然而在治疗的同时往往伴随着严重副作用以及出现多药耐药性。抗癌肽(Anticancer peptides，ACPs)具有选择性高、生物相容性好、肿瘤渗透性高等优点。大多数ACPs是α
‑
螺旋阳离子两亲性肽，其活性主要是由净电荷、疏水性和螺旋度等决定的。相对于正常细胞，癌细胞膜表面携带大量的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等阴离子成分，使癌细胞表面呈现净负电荷。大多数抗癌肽中含有多个赖氨酸与精氨酸，使其带有大量正电荷，这些带有正电荷的抗癌肽可以通过静电相互作用被带负电荷癌细胞膜吸引，进一步形成α
‑
螺旋构象，插入脂质双分子层中，形成孔道、破坏了膜的完整性从而导致癌细胞死亡。精氨酸可以通过侧链胍基离子与细胞膜表面带负电组分相互作用产生大量氢键，从而实现从水溶到膜溶的转变，同时寡聚精氨酸的穿膜能力随着连续精氨酸残基的数目和多肽浓度的增加而增加。此外多肽疏水性氨基酸的增加可以提高多肽的抗癌活性，然而高疏水性通常会产生高溶血性，通过在α
‑
螺旋两亲性肽的疏水侧引入亲水残基降低了疏水力矩，从而降低溶血性。
[0003]肽类药物由于半衰期短、生物利用度低、稳定性差和易被蛋白酶水解等缺点限制了其临床应用。脂肪酸的修饰可以增加肽的膜通透能力，也可以增加抗癌能力，同时脂肪酸修饰的治疗剂(如蛋白质、肽和siRNA)可以延长体内循环时间并避免蛋白酶水解。因此本专利技术设计合成了一种新颖的富含精氨酸的阳离子两亲性抗癌脂肽，其中精氨酸(Arg)能提供正电荷与癌细胞膜表面大量的负电组分通过静电作用结合，此外引入色氨酸(Trp)、亮氨酸(Leu)等氨基酸增加肽链的疏水性来提高破膜活性，通过正辛酸修饰增加肽链的稳定性、增强抗癌作用。专利技术人将本专利技术的抗癌脂肽全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜索对比时，未发现有任何相同多肽。本专利技术抗癌脂肽具备良好的体内外抗癌活性，可对癌症的治疗提供新思路。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是通过固相合成技术合成一种具有优异抗癌活性的抗癌脂肽并将这种抗癌脂肽应用于抗肿瘤治疗。
[0005]为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]本专利技术抗癌脂肽的氨基酸序列为：C8H
15
O
‑
Asp
‑
Ser
‑
Asp
‑
Val
‑
Trp
‑
Trp
‑
Gly
‑
Gly
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu，其技术方案如下：
[0007](1)抗癌脂肽的设计：首先根据阳离子抗癌肽的正电荷性和两亲性，引入带正电荷的精氨酸(Arg)和疏水性的色氨酸(Trp)、亮氨酸(Leu)等氨基酸，并通过氨基酸间的合理的
排列组合使肽链的疏水力矩减小以降低溶血毒性，同时在N末端用正辛酸(C8H
16
O2)修饰，提高多肽的稳定性，最终设计得到阳离子两亲性的抗癌脂肽；
[0008](2)抗癌脂肽通过固相合成法进行制备，其制备方案概括如下：将带有Fmoc保护基和侧链保护基的氨基酸通过脱除Fmoc保护基再使用催化剂催化各氨基酸依次从C端到N端逐个偶联在王树脂(Wang resin)上，然后在N末端偶联正辛酸，最后用三氟乙酸切割树脂并脱除侧链保护基团最终得到抗癌脂肽。本专利技术抗癌脂肽结构式如下：
[0009][0010](3)采用MTT法和流式细胞术对抗癌脂肽的体外抗癌活性进行检测：通过MTT法测试抗癌脂肽对HepG2细胞的细胞毒性，通过Annexin V
‑
FITC/PI凋亡检测试剂盒用流式细胞仪检测抗癌脂肽对HepG2细胞凋亡的影响；
[0011](4)通过圆二色谱(CD)检测抗癌脂肽的二级结构：用水模拟亲水环境，用SDS溶液来模拟细胞膜等疏水环境，通过圆二色谱检测抗癌脂肽在水溶液和SDS溶液中二级结构的变化情况；
[0012](5)对抗癌脂肽的破膜活性进行研究：将抗癌脂肽与HepG2细胞共培养3h后显微镜下观察抗癌脂肽对细胞膜形态的影响，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放试验定量测定抗癌脂肽对癌细胞膜的裂解能力；
[0013](6)对抗癌脂肽溶血和血清稳定性进行研究：预先用胎牛血清(FBS)和抗癌脂肽共培养，然后用MTT检测经FBS预处理后抗癌活性变化来评估其稳定性；通过抗癌脂肽对小鼠红细胞形态变化的影响评估其溶血活性；
[0014](7)抗癌脂肽的体内抗肿瘤活性研究：选用植瘤小鼠作为实验模型，隔天尾静脉注射抗癌脂肽，并对小鼠体重及肿瘤体积进行测量，将小鼠肿瘤组织解剖并进行组织切片和HE染色来检测抗癌脂肽的体内抗肿瘤活性。
附图说明
[0015]图1：MTT法检测抗癌脂肽对HepG2细胞的抗癌活性。(a)将不同浓度的抗癌脂肽与HepG2细胞共培养24h的相对细胞存活率。(b)24μM的抗癌脂肽与HepG2细胞共培养不同时间的相对细胞存活率；
[0016]图2：抗癌脂肽在纯水和SDS溶液中的CD光谱；
[0017]图3：FITC
‑
AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡。通过流式细胞术检测空白对照(a)、4μM(b)、8μM(c)、16μM(d)的脂肽对HepG2细胞凋亡数据图；
[0018]图4：抗癌脂肽的破膜活性。空白对照(a)、8μM(b)、16μM(c)脂肽与HepG2细胞共孵育3h后荧光显微镜(400
×
)观察HepG2细胞形态。(d)不同浓度脂肽与HepG2细胞共培养24h后HepG2细胞的乳酸脱氢酶释放率；
[0019]图5：抗癌脂肽的溶血活性和血清稳定性。小鼠尾静脉注射生理盐水(a)和2.25mg/mL抗癌脂肽(b)2h后取血，显微镜下观察(400
×
)红细胞形态。(c)预先将抗癌脂肽分别与含
10％血清和不含血清的PBS在37℃下孵育24h和48h后通过MTT法检测抗癌脂肽对HepG2细胞的抗癌活性变化数据图；
[0020]图6：抗癌脂肽的体内抗肿瘤活性。(a)植瘤小鼠隔天尾静脉注射抗癌脂肽后体重随时间变化图。(b)植瘤小鼠相对肿瘤体积随时间变化图。(c)隔天注射生理盐水11天后肿瘤组织切片。(d)隔天注射抗癌脂肽11天后肿瘤组织切片(400
×
)。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗癌脂肽，其特征在于，从N端到C端的序列为C8H
15
O
‑
Asp
‑
Ser
‑
Asp
‑
Val
‑
Trp
‑
Trp
‑
Gly
‑
Gly
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu，其中Asp为天冬氨酸，Ser为丝氨酸，Val为缬氨酸，Trp为色氨酸，Gly为甘氨酸，Arg为精氨酸，Leu为亮氨酸，C8H
15
O表示正辛酸(C8H
16
O2)在与N末端Asp的氨基脱水缩合后的分子式，抗癌脂肽具体结构式如下：2.抗癌脂肽C8H
15
O
‑
Asp
‑
Ser
‑
Asp
‑
Val
‑
Trp
‑
Trp
‑
Gly
‑
Gly
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)首先通过固相合成法合成Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
Ser(tBu)
‑
Asp(OtBu)
‑
Val
‑
Trp
‑
(Boc)
‑
Trp(Boc)
‑
Gly
‑
Gly
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Leu
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Wang Resin；称取一定量的Fmoc
‑
Leu
‑
Wang Resin(Fmoc全称为9
‑
芴基甲氧基羰基在此作为氨基保护基)加入DMF(N,N
‑
二甲基甲酰胺)溶胀树脂30min，然后按照DMF：哌啶＝4:1的比例加入哌啶，反应30min脱除Fmoc基团，反应完成后进行抽滤，并依次用DMF、DCM(二氯甲烷)、DMF多次洗涤树脂，重新加入无水DMF溶胀30min，加入两倍摩尔量的Fmoc
‑
Arg(Pbf)
‑
OH(Pbf为Arg的侧链保护基)、2.6倍摩尔量的DCC(二环己基碳二亚胺)、HOBT(1
‑
羟基苯并三唑)和DIEA(N,N
‑
二异丙基乙胺)，在室温下反应48h，反应完成后依次用DMF、DCM、DMF多次洗涤树脂，然后转移到透析袋内(MW：8000
‑
14000)，用无水乙醇透析纯化，将透析完的样品冷冻干燥得Fmoc
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Wang Resin，重复上述步骤依次偶联氨基酸直至合成Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
Ser(tBu)
‑
Asp(OtBu)
‑
Val
‑
Trp(Boc)
‑
Trp(Boc)
‑
Gly
‑
Gly
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Leu
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Wang Resin，其中Boc为Trp侧链保护基，tBu为Ser侧链保护基，OtBu为Asp侧链保护基；(2)C8H
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O
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Asp
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Ser
‑
Asp
‑
Val
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Trp
‑
Trp
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Gly
‑
Gly
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Leu
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Arg
‑
Arg
‑
Leu
‑
Arg
‑
Arg
‑
Leu的合成；首先将Fmoc
‑
Asp(OtBu...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫苗苗，魏光成，霍业鸿，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：