一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法技术

本发明专利技术涉及一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法,利用实时荧光定量PCR、流式细胞分析、间接免疫荧光等技术共同探索肌肉细胞形成时间，方法切实可行，可用以大量分析胚盘内肌肉细胞占多个细胞的比例，以及何时肌肉细胞形成并表达标记蛋白，对研究胚盘发育、肌肉细胞形成、建立肌肉细胞形成调控网络等有重要指导意义，极大地丰富了胚胎发育生物学研究；本发明专利技术可推广到采用不同种类家禽的胚胎期胚盘，分析胚盘内各种细胞何时形成并分化发育，为研究整体胚胎发育，解密遗传规律奠定基础；本发明专利技术鉴定方法更为简便、灵敏和高效，可以检测胚胎期基因和蛋白的微弱表达，能更加真实地反映目的细胞形成情况，也可以应用于其他禽类研究中。中。中。

【技术实现步骤摘要】
一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法


[0001]本专利技术涉及一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法，属于生物


技术介绍

[0002]肌肉性状是影响家禽肉品质的重要性状。在胚胎期肌生成的过程中，骨骼肌细胞的发生可以分为多个细胞阶段，包括胚胎干细胞、体节细胞、肌源性干细胞、成肌细胞和多核肌管。肌纤维是构成肌肉的基本单位，它是由动物胚胎期的胚胎干细胞分化为体节细胞再通过一系列增殖、迁移、分化后形成的。肌肉发育过程主要分为两个阶段：第一阶段是成肌细胞形成的过程，主要由体节细胞迁移到机体各部位，并大量增殖，这一过程称为肌肉初级发育；第二阶段是肌管形成，并进一步分化为肌纤维的过程，该阶段称为次级肌肉发育。肌细胞的形成和发育是一个由多种键转录因子协同调控的复杂过程，一些经典的成肌分化的调节因子参与其中，如：生肌调控因子 4（Myogenic Regulatory Factor 4，MRF4）、生肌决定因子（Myoblast Determination Protein，MyoD）、肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）、生肌因子 5（Myogenic factor 5，Myf5）、成对的框转录因子3（The Paired Box Transcription Factor 3，PAX3）、成对的框转录因子 7（The Paired Box Transcription Factor 7，PAX7）等。这些因子在胚胎期成肌分化的不同时期表达，贯穿了成肌分化的整个过程，并对肌细胞分化和肌纤维形成发挥着重要的调控作用。但是，这些基因最初在鸡胚胎的何种时期出现并表达至今尚无定论。了解肌细胞的形成和关键基因的表达对研究肉品质性状有着重要的指导作用，现阶段对胚胎期肌生成的研究盲点限制了我们尽早在源头改善肌肉质量的应用，亟需进一步探索与发现。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于针对上述现有技术问题，提供一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法。
[0004]本专利技术的目的是这样实现的: 一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）收集入孵0
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12h的鸡胚，每隔三小时取样一次，敲开蛋壳剪下卵黄膜，放入PBS内清洗并摇出胚盘，再用PBS清洗两遍，放至无酶离心管里备用；（2）提取胚盘RNA，测其浓度后将其反转录成cDNA单链，统一上样量10ng/μL，利用实时荧光定量PCR检测肌肉细胞标记基因PAX3、Myf5、MyOD、MyOG的表达量；（3）取收集到离心管内的各组细胞，以不加抗体的胚盘细胞做阴性对照，通过流式细胞分析技术经封闭、透膜、一抗孵育后由荧光二抗检测肌肉细胞标记蛋白PAX3的阳性率；（4）采用滴片法将各组细胞进行间接免疫荧光检测，前期将细胞固定于玻片上，而后步骤同流式细胞分析，观察特异性荧光确定阳性细胞存在情况。
[0005]步骤（1）中，每隔三小时取样一次，在0h、3h、6h、9h、12h各取样一次。
[0006]步骤（2）中，用TRIzol法提取胚盘RNA。
[0007]本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，提供的一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法，该方法成本低、易操作，为肌肉细胞在胚胎早期的相关研究中定位的准确性和进一步应用奠定基础，使从胚胎早期调控家禽肉质等工作有了新思路。本专利技术适用于家禽胚胎期肌肉细胞的鉴定，分析结果准确可靠，实验处理过程和分组合理。此方法为后期完善相应的关键转录因子和信号通路，绘制肌肉细胞形成调控网络，为大量体外培养肌肉细胞、体内诱导获得多肌纤维的家禽肉质奠定实验数据和理论基础。
[0008]本专利技术的优越性在于：1、本专利技术利用实时荧光定量PCR、流式细胞分析、间接免疫荧光等技术共同探索肌肉细胞形成时间，方法切实可行，可用以大量分析胚盘内肌肉细胞占多个细胞的比例，以及何时肌肉细胞形成并表达标记蛋白，对研究胚盘发育、肌肉细胞形成、建立肌肉细胞形成调控网络等有重要指导意义，极大地丰富了胚胎发育生物学研究；2、本专利技术适用范围广，可推广到采用不同种类家禽的胚胎期胚盘，分析胚盘内各种细胞何时形成并分化发育，为研究整体胚胎发育，解密遗传规律奠定基础；3、本专利技术中的鉴定方法更为简便、灵敏和高效，可以检测胚胎期基因和蛋白的微弱表达，能更加真实地反映目的细胞形成情况，也可以应用于其他禽类研究中，具有很好的推广应用价值。
附图说明
[0009]图1是本专利技术胚胎早期肌肉特异性基因的qRT
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PCR鉴定图；图2 是本专利技术胚胎早期肌肉标记蛋白流式分析鉴定图；图3 是本专利技术胚胎早期肌肉标记蛋白间接免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
[0010]以下结合附图以及附图说明书对本专利技术做进一步说明。
[0011]1. 收集鸡胚胎早期的胚盘组织；取母鸡刚产的受精鸡胚若干枚，放进孵化箱分别入孵0h、3h、6h、9h、12h，孵化为温度38.2℃，相对湿度70%，取出鸡胚后经0.1%新洁尔灭溶液和75%乙醇杀菌消毒。用高压过的眼科镊敲开钝端，在不使卵黄破裂的情况下尽量去除蛋清，用药匙将胚盘位置调整至视野正中央，使用眼科剪沿胚盘四周将卵黄膜剪成正方形状，眼科镊轻提放入无菌PBS内清洗，通过振荡使胚盘完全剥落下来，用巴氏吸管小心吸取胚盘并清洗两遍，最后加入到无酶离心管内，整个过程应尽量保持胚盘完整。
[0012]2. 提取胚盘组织RNA；取胚盘组织加1 mL Trizol试剂充分混匀使其裂解，前期孵化处理时间长的胚盘可以用匀浆机破碎组织，室温静置5分钟充分破裂细胞以释放RNA，加200 μL氯仿抽提苯酚，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，使RNA进入水相。4℃ 12000g离心15分钟取上清，加入等量异丙醇溶液室温静置10分钟，此时可见胶状沉淀RNA，4 ℃离心10 min弃上清，加75%乙醇可见清晰沉淀，再次4 ℃离心5min（转速改为7500g）去上清，之后晾干、加TE或蒸馏水溶解RNA沉淀（可放60℃烘箱促融5分钟使RNA迅速溶于水中）。
[0013]3. 定量检测肌肉细胞特异性基因的表达
测定好各个样品RNA的浓度，控制其总质量相同，数值在1 pg ~ 1 μg，加入4
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gDNA wiper Mix 4 μL清除基因组DNA，加水补足16 μL，混合均匀后于PCR仪内42 ℃处理2分钟。加5
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HiScript
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4 μL进行反转录，PCR反应程序为37 ℃ 15分钟，85 ℃ 5秒，之后样品可在
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20℃保存半年之久。在qPCR管中配置反应液：2
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ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 10 μL，上游引物F 0.4 μL，下游引物R 0.4 μL，模板cDNA 10 ng/μL，加ddH2O至20 μL；反应程序为95 ℃ 30秒，（95 ℃ 10秒，60 ℃ 30秒15分钟）
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40个循坏，95 ℃ 15秒，60 ℃ 60秒，95 ℃ 15秒。定量相关的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种探究胚胎期肌肉细胞形成时间的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）收集入孵0
‑
12h的鸡胚，每隔三小时取样一次，敲开蛋壳剪下卵黄膜，放入PBS内清洗并摇出胚盘，再用PBS清洗两遍，放至无酶离心管里备用；（2）提取胚盘RNA，测其浓度后将其反转录成cDNA单链，统一上样量10ng/μL，利用实时荧光定量PCR检测肌肉细胞标记基因PAX3、Myf5、MyOD、MyOG的表达量；（3）取收集到离心管内的各组细胞，以不加抗体的胚盘细胞做阴性对照，通过流式细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳锴，周静，牛英杰，左其生，孙红艳，张亚妮，李碧春，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：