头颈鳞癌治疗分子探针及应用制造技术

本发明专利技术提供头颈鳞癌治疗分子探针及应用，涉及头颈鳞癌治疗技术领域。该头颈鳞癌治疗分子探针，硒化合物对头颈鳞癌细胞基因组稳定性的影响进行研究：首先研究硒化合物激活ATR通路的作用；其次硒化合物对TCAB1转录失活的作用分析；再研究ATR通路和TCAB1通路的相互作用；最后分析硒化合物作用下头颈鳞癌细胞的基因组稳定性干预治疗的可行性；研究时所述肿瘤细胞基因组包括两种人口腔鳞癌细胞系(HSC

【技术实现步骤摘要】
头颈鳞癌治疗分子探针及应用


[0001]本专利技术涉及头颈鳞癌治疗
，具体为头颈鳞癌治疗分子探针及应用。

技术介绍

[0002]头颈部恶性肿瘤的发病率居全身恶性肿瘤第6位，其中90％以上为鳞状细胞癌，尽管在过去的20年间治疗方法不断改进，但其五年生存率仍在50％左右，目前临床上针对头颈鳞癌高复发率、高转移率及放化疗抵抗尚无有效措施。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了头颈鳞癌治疗分子探针及应用，解决了临床上针对头颈鳞癌高复发率、高转移率及放化疗抵抗尚无有效措施的问题。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：头颈鳞癌治疗分子探针及应用，硒化合物对头颈鳞癌细胞基因组稳定性的影响进行研究：
[0007]步骤一.研究硒化合物激活ATR通路的作用；
[0008]步骤二.硒化合物对TCAB1转录失活的作用分析；
[0009]步骤三.研究ATR通路和TCAB1通路的相互作用；
[0010]步骤四.分析硒化合物作用下头颈鳞癌细胞的基因组稳定性干预治疗的可行性；
[0011]研究时所述肿瘤细胞基因组包括两种人口腔鳞癌细胞系(HSC
‑
3、Cal
‑
27)、鼻咽癌细胞系CNE1和腺样囊性癌细胞系ACC2，所述硒化合物的作用试剂为亚硒酸钠与硒代
‑
L
‑
蛋氨酸。
>[0012]优选的，所述步骤一中的具体研究方法如下：
[0013]a.系统分析ATR通路信号传导在硒化合物处理头颈鳞癌细胞中的分子表达：利用免疫荧光和免疫印迹检测ATRIP，TopBP1，9
‑1‑
1和Mre11
‑
Rad50
‑
Nbs1复合体，H2AX，CTIP和PCNA信号分子灶点形成的能力；
[0014]b.单链DNA中间体的形成：利用磷酸化RPA和非变性BrdU免疫荧光手段，检测硒化合物处理头颈鳞癌细胞中单链DNA(ssDNA)的形成能力；
[0015]c.DNA复制叉的稳定性：BrdU和IdU交互标记细胞，观察紫外线或喜树碱处理头颈鳞癌细胞细胞后IdU单色荧光标记区域的长度，以指示复制叉重启和延伸的能力；
[0016]d.硒化合物作用蛋白的筛选：构建腺病毒载体，表达带有TAP标签的硒化合物相关蛋白,制备高滴度腺病毒载体并感染头颈鳞癌细胞(108细胞数)，提取总蛋白或核蛋白，利用共价结合兔IgG的磁珠(Dynal beads)特异吸附硒化合物TAP及相互作用蛋白质复合体，经SDS
‑
PAGE电泳分离选切特异蛋白条带后MALDI
‑
TOF或液相色谱关联的质谱分析，鉴定多肽指纹，筛选与ATR通路相关的靶蛋白。
[0017]优选的，所述步骤二中的具体研究方法如下：
[0018]a.硒化合物对端粒酶复合体各成分含量和Cajal体定位的影响：TRAP
‑
ELISA检测端粒酶活性；Southernblot检测端粒长度；Westernblot检测TCAB1、hTERT、dyskerin；Nothern blot检测hTR水平；利用TCAB1、p80
‑
coilin(CB的标志蛋白)、dyskerin和hTERT的抗体进行免疫共沉淀实验检测TCAB1在硒化合物作用下与dyskerin、hTERT、CB的相互作用，结合FISH实验检测TCAB1与hTR的相互作用；
[0019]b.硒化合物对TCAB1启动子顺式插入调控:在数据库查找TCAB1基因的启动子序列，设计引物进行PCR扩增，对PCR产物进行454测序，比对硒化合物阳性和硒化合物阴性组的TCAB1启动子序列的变化；
[0020]c.硒化合物对TCAB1调控的信号传导途径研究：拟采用基因芯片技术比较硒化合物阳性和硒化合物阴性组肿瘤细胞的基因表达谱差异性，用生物信息学GSEA进行聚类分析、pathwa分析，寻找到参与这些效应分子(NF
‑
κB、c
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Myc、Sp1、PKC、p53)调节的信号途径，并用实时荧光定量PCR或Western Blot技术验证主要信号分子的变化，确定硒化合物失活TCAB1可能的信号转导途径；
[0021]d.TCAB1启动子结合蛋白的垂钓：构建TAP
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TCAB1腺病毒载体，感染硒化合物阳性和硒化合物阴性组，提取总蛋白或核蛋白，用磁珠特异吸附TCAB1
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TAP及相互作用蛋白质复合体，经MALDI
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TOF分析，鉴定多肽指纹，筛选与TCAB1激活通路相关的信号蛋白(c
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Myc、Sp1、PKC、p53)。
[0022]优选的，所述步骤三中的具体研究方法如下：
[0023]a.阻断ATR通路对TCAB1表达及相关信号分子的影响：根据步骤一部分的研究结果鉴定出了ATR通路，用ATR抑制剂或siRNA阻断该通路中关键信号分子(ATR、H2AX、TopBP1、Chk1)，检测硒化合物作用组和未作用组细胞中TCAB1的表达、CB定位及相关信号分子的表达(c
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Myc、Sp1、PKC、p53)；
[0024]b.TCAB1通路基因沉默对ATR通路的影响：根据步骤二部分筛选出的TCAB1信号通路，合成TCAB1的siRNA，硒化合物作用下，检测DNA损伤活化灶，分析ATRIP、TopBP1的表达以检测对ATR通路的影响。
[0025]优选的，所述步骤三中的具体研究方法如下：
[0026]以基因组稳定性干预小分子探针(ATR通路抑制剂或TCAB1通路siRNA)，处理硒化合物阳性组肿瘤细胞，观察联合喜树碱或放射处理后的细胞的增殖、凋亡、衰老细胞存活能力的指标，筛选有潜力的联合杀伤小分子化学物质。
[0027](三)有益效果
[0028]本专利技术提供了头颈鳞癌治疗分子探针及应用。具备以下有益效果：
[0029]本专利技术利用分子细胞生物学技术进一步阐明硒化合物激活ATR通路信号传导的分子机制，硒化合物降低TCAB1表达和信号传导的分子机制，两条通路的相互作用和导致基因组不稳定、杀伤肿瘤的机制，从而筛选硒化合物作用下对头颈鳞癌有致敏作用的基因组稳定性干预应答通路的小分子探针，以期为临床头颈鳞癌的治疗提供新的思路和方法。
附图说明
[0030]图1为本专利技术头颈鳞癌治疗分子探针的研究技术流程图；
[0031]图2为本专利技术头颈鳞癌治疗分子探针的ATR通路激活过程示意图；
[0032]图3为本专利技术头颈鳞癌治疗分子探针的TCAB1在端粒合成途径中的功能模式图；
[0033]图4为本专利技术细胞培养图；
[0034]图5为本专利技术克隆形成实验图；
[0035]图6为本专利技术Tunel检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.头颈鳞癌治疗分子探针及应用，其特征在于：对硒化合物对头颈鳞癌细胞基因组稳定性的影响进行研究：步骤一.研究硒化合物激活ATR通路的作用；步骤二.硒化合物对TCAB1转录失活的作用分析；步骤三.研究ATR通路和TCAB1通路的相互作用；步骤四.分析硒化合物作用下头颈鳞癌细胞的基因组稳定性干预治疗的可行性；研究时所述肿瘤细胞基因组包括两种人口腔鳞癌细胞系(HSC
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3、Cal
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27)、鼻咽癌细胞系CNE1和腺样囊性癌细胞系ACC2，所述硒化合物的作用试剂为亚硒酸钠与硒代
‑
L
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蛋氨酸。2.根据权利要求1所述的头颈鳞癌治疗分子探针，其特征在于：所述步骤一中的具体研究方法如下：a.系统分析ATR通路信号传导在硒化合物处理头颈鳞癌细胞中的分子表达：利用免疫荧光和免疫印迹检测ATRIP，TopBP1，9
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1和Mre11
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Rad50
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Nbs1复合体，H2AX，CTIP和PCNA信号分子灶点形成的能力；b.单链DNA中间体的形成：利用磷酸化RPA和非变性BrdU免疫荧光手段，检测硒化合物处理头颈鳞癌细胞中单链DNA(ssDNA)的形成能力；c.DNA复制叉的稳定性：BrdU和IdU交互标记细胞，观察紫外线或喜树碱处理头颈鳞癌细胞细胞后IdU单色荧光标记区域的长度，以指示复制叉重启和延伸的能力；d.硒化合物作用蛋白的筛选：构建腺病毒载体，表达带有TAP标签的硒化合物相关蛋白,制备高滴度腺病毒载体并感染头颈鳞癌细胞(108细胞数)，提取总蛋白或核蛋白，利用共价结合兔IgG的磁珠(Dynal beads)特异吸附硒化合物TAP及相互作用蛋白质复合体，经SDS
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PAGE电泳分离选切特异蛋白条带后MALDI
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TOF或液相色谱关联的质谱分析，鉴定多肽指纹，筛选与ATR通路相关的靶蛋白。3.根据权利要求1所述的头颈鳞癌治疗分子探针，其特征在于：所述步骤二中的具体研究方法如下：a.硒化合物对端粒酶复合体各成分含量和Cajal体定位的影响：TRAP
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ELISA检测端粒酶活性；Southern blot检测端粒长度；Western blot检测TCAB1、hTERT、dyskerin；Nothern blot检测hTR水平；利用TCAB1、p80
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coilin(CB的标志蛋白)、dyskerin和hTERT的抗体进行免疫共沉淀实验检测TC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，
申请(专利权)人：张波，
类型：发明
国别省市：