一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法技术

本发明专利技术属于基础研究技术领域，公开了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括：准备相关病毒的载体；进行目的基因和指示基因的克隆；进行VIGS重组载体的构建；进行病毒诱导的基因沉默的实验。本发明专利技术的病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，利用烟草脆裂病毒(TRV，Tobravirus)介导进行藜麦基因功能验证，涉及利用TRV(Tobravirus，烟草脆裂病毒)病毒载体，以藜麦PDS(phytoene desaturase，八氢番茄红素脱氢酶)基因为标记基因，在藜麦中通过TRV病毒介导的VIGS体系进行基因的功能分析方法。毒介导的VIGS体系进行基因的功能分析方法。毒介导的VIGS体系进行基因的功能分析方法。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法


[0001]本专利技术属于基础研究
，尤其涉及一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法。

技术介绍

[0002]目前，藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)属于苋科藜属一年生植物，籽粒具有极高的营养价值，其蛋白质含量远超其他粮食，富含多种人体必需氨基酸、且含量均衡，藜麦中还含有丰富的矿物质、不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、皂苷等活性物质，具有抗氧化、降血脂、增强免疫等生理功效，进而能够降低患一些疾病的风险等生理功能。此外，籽粒不含麸质，特别适合对麸质过敏的人群，具有增强其免疫力的作用。
[0003]近年来，随着人们对健康需求的提高，对藜麦产量的需求也大量增加。由于藜麦花序呈圆锥型，具有多级分枝，花序(穗)大而紧密，藜麦的花小，藜麦的花由不同大小的雌花及两性花组成，比例受到遗传和环境的影响。两性花有4～8个花药与萼片对生，1个上位子房，子房上柱头有2或3个分枝，主要分布于主花枝和次级花枝的顶端；雌花有三种类型，按花被的存在与缺失分为具花被的大雌花、具花被的小雌花和无花被的小雌花。
[0004]由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。因此，亟需一种新的藜麦基因功能的验证方法。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，尤其涉及一种通过病毒介导的基因沉默(virus
‑
induced gene silencing，VIGS)进行藜麦基因功能验证的方法。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：
[0008]步骤一，准备相关病毒的载体；
[0009]步骤二，进行目的基因和指示基因的克隆；
[0010]步骤三，进行VIGS的重组载体的构建；
[0011]步骤四，进行病毒诱导的基因沉默的实验。
[0012]进一步，步骤三中，所述VIGS的重组载体的构建，包括：
[0013]指示基因，即PDS基因和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶
BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因
‑
病毒连接的重组载体和病毒
‑
目的基因连接的重组载体。
[0014]进一步，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：
[0015]提取藜麦叶和花序的RNA，反转合成cDNA第一链；根据NCBI中公布的玉米PDS基因序列XM_021864666.1和预测的藜麦AMS基因序列，选择PDS和AMS的VIGS干扰靶标片段长度分别为461bp和498bp；以藜麦叶片的cDNA第一链为板，PCR扩增CqPDS基因片段，分别在上下游引入BamHI和EcoRI酶切位点和保护碱基；用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，根据PCR产物纯化试剂盒说明回收目的片段，将其与pGEM
‑
T Easy载体连接，测序验证后再分别插入载体pTRV2中，获得重组VIGS载体pTRV2
‑
CqPDS和pTRV2
‑
CqAMS，测序验证正确后备用。
[0016]进一步，所述扩增PDS引物Cq_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述扩增AMS引物Cq_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述检测PDS引物RT_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测AMS引物RT_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内参基因引物Cq_ACT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0017]进一步，所述VIGS的载体构建，包括：
[0018]PDS基因和AMS基因扩增片段于pTRV2载体同时采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为重组载体pTRV2
‑
CqPDS和pTRV2
‑
CqAMS。
[0019]进一步，步骤四中，所述病毒诱导的基因沉默的实验，包括：
[0020](1)病毒及其重组载体的农杆菌侵染液的制备；
[0021](2)藜麦材料的准备及注射侵染；
[0022](3)qRT
‑
PCR检测目的基因是否沉默。
[0023]进一步，步骤(1)中，所述病毒及其重组载体的农杆菌侵染液制备，包括：
[0024]将病毒质粒、空载体、指示基因
‑
病毒连接的重组载体及病毒
‑
目的基因连接的重组载体分别转化农杆菌感受态细胞；分别挑取阳性农杆菌单菌落，接种至2mL含有50mg/mL卡那霉素Kan和50mg/mL利福平Rif的YEB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养16h，菌液PCR检测正确后，再将菌液以1：100的体积比转接至50mg/mL Kan和50mg/mL Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600＝0.6，将各菌液的OD600值调整至一致；5000r/min离心收集，用侵染缓冲液重悬农杆菌；将OD600调至1.0，再按照1：1的比例混合含有病毒的农杆菌菌液和空载体、指示基因
‑
病毒连接的重组载体及病毒
‑
目的基因连接的重组载体的农杆菌菌液摇晃混匀后得到VIGS转化的侵染液。
[0025]进一步，所述侵染缓冲液包括50mmol/L AS贮存液、1mol/L MES贮存液和1mol/L MgCl2，pH 5.6。
[0026]进一步，步骤(2)中，所述藜麦材料的准备及注射侵染，包括：
[0027]藜麦长出第一对真叶后的第十天进行注射，将含有病毒载体的农杆菌侵染液、含有指示基因
‑
病毒的重组载体农杆菌侵染液、含有目的基因
‑
病毒的重组载体农杆菌侵染液
注射到藜麦叶片内，以注射含有病毒的空本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：步骤一，准备相关病毒的载体；步骤二，进行目的基因和指示基因的克隆；步骤三，进行VIGS的重组载体的构建；步骤四，进行病毒诱导的基因沉默的实验。2.如权利要求1所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，步骤三中，所述VIGS的重组载体的构建，包括：指示基因，即PDS基因和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因
‑
病毒连接的重组载体和病毒
‑
目的基因连接的重组载体。3.如权利要求2所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：提取藜麦叶和花序的RNA，反转合成cDNA第一链；根据NCBI中公布的玉米PDS基因序列XM_021864666.1和预测的藜麦AMS基因序列，选择PDS和AMS的VIGS干扰靶标片段长度分别为461bp和498bp；以藜麦叶片的cDNA第一链为板，PCR扩增CqPDS基因片段，分别在上下游引入BamHI和EcoRI酶切位点和保护碱基；用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，根据PCR产物纯化试剂盒说明回收目的片段，将其与pGEM
‑
T Easy载体连接，测序验证后再分别插入载体pTRV2中，获得重组VIGS载体pTRV2
‑
CqPDS和pTRV2
‑
CqAMS，测序验证正确后备用。4.如权利要求3所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述扩增PDS引物Cq_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述扩增AMS引物Cq_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述检测PDS引物RT_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测AMS引物RT_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内参基因引物Cq_ACT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。5.如权利要求2所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，其特征在于，所述VIGS的载体构建，包括：PDS基因和AMS基因扩增片段于pTRV2载体同时采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后将酶切产物进行DNA纯化，用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经PCR鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为重组载体pTRV2
‑
CqPDS和pTRV2
‑
CqAMS。6.如权利要求1所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦...

【专利技术属性】
技术研发人员：林春，刘正杰，张玉敏，毛自朝，林彤，何芳蕾，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：