一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术中公开了一种质粒载体，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，将上述质粒载体进行体外转录，然后将体外转录的RNA转染BHK

【技术实现步骤摘要】
一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸭坦布苏病毒(DTMUV)是能引起蛋鸭产蛋下降综合征，甚至致死性脑炎的一种新型黄病毒。自2010年在中国东南沿海地区首次爆发以来，迅速扩散大到全国多个省市，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。经病原的分离与鉴定确定引起该病的病原为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)。
[0003]当前对该病的防控措施主要还是通过疫苗免疫来进行，虽然已有商品化的减毒活疫苗和灭活疫苗，但已有的商品化灭活疫苗免疫效果不够理想，需要多次增强免疫，加大了鸭群的应激反应。而现有的减毒活疫苗都是通过传统连续传代方式获得，安全风险较高。所以，当前的DTMUV的疫苗仍有很大的提高空间，尤其尤其需要研制一种安全性高、免疫效果好的DTMUV减毒活疫苗。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的鸭坦布苏病毒减毒活疫苗安全性低、免疫效果差的问题，提供一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种质粒载体，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]优选地，所述质粒载体命名为pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC，所述质粒载体包含IRES元件，所述IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
[0007]优选地，将质粒载体pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC中的IRES元件的5
’
端序列进行截短，截短后的IRES元件命名为MINI
‑
IRES元件，所述MINI IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；获得的截短后的质粒载体命名为pACYC
‑
CQW1
‑
MINI
‑
mC。
[0008]进一步优选，所述pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC的制备方法包括以下步骤：
[0009]S1、以pACYC
‑
FL
‑
TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段P1A；以IRES
‑
RLuc
‑
pA质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段P1B，所述P1B为IRES元件；以pUC57
‑
mC质粒为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，PCR扩增得到片段P1C，mC基因进行了同义密码子突变，但不改变mC的氨基酸残基的序列,防止潜在的RNA重组的影响；以pACYC
‑
FL
‑
TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，PCR扩增得到片段P1D；通过融合PCR将片段P1A、P1B、P1C和P1D依次进行融合，获得片段P1
‑
IRES
‑
mC；将片段P1
‑
IRES
‑
mC与线性化后的pACYC
‑
CQW1
‑
P2
‑
6质粒进行连接，筛选获得pACYC
‑
CQW1
‑
P2
‑6‑
IRES
‑
mC质粒；
[0010]S2、以pACYC
‑
FL
‑
TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物，PCR扩增得到片段ΔC
‑
A；再以序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物，PCR扩增得到片段
ΔC
‑
B；通过融合PCR将片段ΔC
‑
A和片段ΔC
‑
B连接起来，获得ΔC片段；
[0011]S3、将ΔC片段与线性化后的pACYC
‑
CQW1
‑
P2
‑6‑
IRES
‑
mC质粒进行连接，筛选获得质粒载体pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC。
[0012]本专利技术提供上述质粒载体在黄病毒减毒活疫苗制备中的应用。
[0013]本专利技术还提供一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，将上述质粒载体进行体外RNA转录，然后将体外转录的RNA转染BHK
‑
21细胞，获得鸭坦布苏病毒弱毒株。
[0014]本专利技术同时提供由上述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株及该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏减毒活疫苗制备中的应用。
[0015]本专利技术所具有的有益效果：
[0016]一)本专利技术将鸭坦布苏CQW1株病毒的结构蛋白C(capsid)蛋白在病毒基因组内进行了异位表达，即把原本的C蛋白删除后，利用内部核糖体进入位点(IRES元件或MINI
‑
IRES元件)在病毒的3
’
UTR区域表达同义密码子更换的C蛋白，由于独立于病毒多聚蛋白表达的C蛋白无法被NS2A有效募集到病毒的组装位点，导致其病毒粒子的组装过程受损，显著降低病毒组装/释放过程的效率，因此获得了两株重组致弱病毒(CQW1
‑
IRES
‑
mC病毒株和CQW1
‑
MINI
‑
mC病毒株)。
[0017]二)本专利技术制备的重组致弱病毒(CQW1
‑
IRES
‑
mC病毒株和CQW1
‑
MINI
‑
mC病毒株)在BHK
‑
21细胞上的复制显著降低，对鸭胚和雏鸭的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平。同时单剂量CQW1
‑
IRES
‑
mC病毒或CQW1
‑
MINI
‑
mC病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。
附图说明
[0018]图1为实施例2中质粒载体pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC和pACYC
‑
CQW1
‑
MINI
‑
mC的构建示意图；
[0019]图2为实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒载体，其特征在于，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体命名为pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC，所述质粒载体包含IRES元件，所述IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，将质粒载体pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC中的IRES元件的5
’
端序列进行截短，截短后的IRES元件命名为MINI
‑
IRES元件，所述MINI IRES元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；获得的截短后的质粒载体命名为pACYC
‑
CQW1
‑
MINI
‑
mC。4.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，所述pACYC
‑
CQW1
‑
IRES
‑
mC的制备方法包括以下步骤：S1、以pACYC
‑
FL
‑
TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段P1A；以IRES
‑
RLuc
‑
pA质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段P1B，所述P1B为IRES元件；以pUC57
‑
mC质粒为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，PCR扩增得到片段P1C；以pACYC
‑
FL
‑
TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，PCR扩增得到片段P...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈舜，贺煜，程安春，汪铭书，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：