利用苏氨酸合成丙酸的方法及其所用重组菌技术

本发明专利技术公开了重组菌所述重组菌表达2

【技术实现步骤摘要】
利用苏氨酸合成丙酸的方法及其所用重组菌


[0001]本专利技术涉及微生物和基因工程领域，具体涉及用苏氨酸合成丙酸的方法及其所用重组菌。

技术介绍

[0002]恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是第一个被美国卫生部重组DNA委员会(Recombinant DNA Advisory Committee，RAC)认定为对环境安全的革兰氏阴性细菌(1982年)，并许可KT2440作为基因工程的宿主菌。恶臭假单胞菌KT2440(P.putida KT2440)能够分解环境中的一些有机物，具有生物催化、生物排污等功能，是一种具有极高的工业催化价值的微生物。
[0003]大肠杆菌作为目前最常见的生物催化宿主之一，已经有多种生物化工产品实现了量产，但利用大肠杆菌生产丙酸并不多见。
[0004]丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除草剂合成、有机合成中间体等方面。目前主要利用丙酸杆菌厌氧发酵生产丙酸，发酵周期一般在10天以上，副产物，如乙酸、琥珀酸等杂质有机酸较多，存在反应条件苛刻、不宜分离纯化等缺点。降低生产成本，提高转化率是丙酸工业化生产中急需解决的问题。
[0005]L
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苏氨酸是一种必需氨基酸，主要通过微生物发酵的方法制备，目前已经具备成熟的生产工艺，且全球产能面临过剩的风险。综合分析恶臭假单胞菌KT2440的代谢途径，利用L
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苏氨酸生产更高附加值的高纯度丙酸，具有更加广阔的市场和价值。在之前的专利中，已经探索了L
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苏氨酸作为底物，经过催化生成2
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酮丁酸后，在辅酶CoA的参与下生成丙酰CoA，进一步生成丙酸。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供新的构建途径获得重组菌，所述重组菌可用于催化苏氨酸获得丙酸。
[0007]为实现上述目的，第一个方面，本专利技术提供重组菌，所述重组菌表达2
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酮异戊酸脱酸酶(也叫酮酸脱羧酶)。
[0008]所述2
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酮异戊酸脱酸酶可选自下述任一种蛋白质：
[0009]A1)由编码链的编码序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子编码的蛋白质；
[0010]A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有2
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酮异戊酸脱酸酶活性的蛋白质；
[0011]A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0012]进一步地，上述的重组菌可为将受体菌的基因组进行改造得到的重组菌，所述改造可包括使所述受体菌表达所述2
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酮异戊酸脱酸酶，所述受体菌可为假单胞菌或大肠杆菌。
[0013]进一步地，上述的重组菌，所述使所述受体菌表达2
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酮异戊酸脱酸酶可为将所述2
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酮异戊酸脱酸酶的编码基因kivD导入受体菌中。
[0014]所述kivD的可为g1)
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g3)中任一项所示：
[0015]g1)编码链的编码序列如SEQ ID No.3所示；
[0016]g2)编码链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0017]g3)与g1)或g2)具有80％以上的同一性，且编码上述2
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酮异戊酸脱酸酶的核苷酸序列。
[0018]进一步地，上述的重组菌，所述受体菌可为假单胞菌，所述改造可包括：
[0019]a1)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；
[0020]a2)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性；
[0021]a3)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性；
[0022]a4)提高或增强所述假单胞菌中的苏氨酸转运酶的活性；
[0023]a5)提高或增强所述假单胞菌中的苏氨酸脱氨酶的活性。
[0024]进一步地，上述的重组菌中，a4)中所述苏氨酸转运酶可选自下述任一种蛋白质：
[0025]B1)由编码链的编码序列如SEQ ID No.1第617
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1648位核苷酸所示的DNA分子编码的蛋白质；
[0026]B2)将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸转运酶活性的蛋白质；
[0027]B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0028]a5)中所述苏氨酸脱氨酶可选自下述任一种蛋白质：
[0029]C1)由编码链的编码序列如SEQ ID No.2第617
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2161位核苷酸所示的DNA分子编码的蛋白质；
[0030]C2)将C1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸脱氨酶活性的蛋白质；
[0031]C3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0032]本专利技术所述的重组菌中，所述苏氨酸醛缩酶的编码基因为ltaE基因，所述甲基柠檬酸合成酶的编码基因为ilvA基因，所述丙酰辅酶A合成酶的编码基因为prpE基因，所述苏氨酸转运酶的编码基因为tdcC基因，所述苏氨酸脱氨酶的编码基因为ilvA基因。
[0033]进一步地，上述的重组菌中，所述a1)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为ltaE基因的苏氨酸醛缩酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
[0034]所述a2)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为prpC基因的甲基柠檬酸合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
[0035]所述a3)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为prpE基因的丙酰辅酶A合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
[0036]所述a4)中，所述提高或增强假单胞菌中的苏氨酸转运酶的活性可为将名称为tdcC基因的所述苏氨酸转运酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中；
[0037]所述a5)中，所述提高或增强所述假单胞菌的苏氨酸脱氨酶的活性可为将名称为ilvA基因的所述苏氨酸脱氨酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中。
[0038]进一步地，上述的重组菌，D1)可通过将所述假单胞菌基因组中的所述ltaE基因替换为含有所述ilvA基因及其启动子的片段实现所述a1)和所述a5)的改造，和/或，D2)可通过将所述假单胞菌基因组中的所述prpC基因替换为含有所述tdcC基因及其启动子的片段实现所述a2)和所述a4)的改造。
[0039]进一步地，上述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组菌，其特征在于：所述重组菌表达2
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酮异戊酸脱酸酶(也叫酮酸脱羧酶)。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将受体菌的基因组进行改造得到的重组菌，所述改造包括使所述受体菌表达所述2
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酮异戊酸脱酸酶，所述受体菌为假单胞菌或大肠杆菌。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述受体菌为假单胞菌，所述改造包括：a1)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；a2)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性；a3)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性；a4)提高或增强所述假单胞菌基因组中的苏氨酸转运酶的活性；a5)提高或增强所述假单胞菌基因组中的苏氨酸脱氨酶的活性。4.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于：所述a1)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性为将所述假单胞菌基因组中名称为ltaE基因的苏氨酸醛缩酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；所述a2)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性为将所述假单胞菌基因组中名称为prpC基因的甲基柠檬酸合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；所述a3)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性为将所述假单胞菌基因组中名称为prpE基因的丙酰辅酶A合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；所述a4)中，所述提高或增强假单胞菌表达苏氨酸转运酶为将名称为tdcC基因的所述苏氨酸转运酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中；所述a5)中，所述提高或增强所述假单胞菌表达苏氨酸脱氨酶为将名称为ilvA基因的所述苏氨酸脱氨酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中。5.根据权利要求3或4所述的重组菌，其特征在于：D1)通过将所述假单胞菌基因组中的所述ltaE基因替换为含有所述ilvA基因及其启动子的片段实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟庆璇，陶勇，于波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：