检测盖塔病毒的荧光RT-RAA引物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了检测盖塔病毒的荧光RT

【技术实现步骤摘要】
检测盖塔病毒的荧光RT
‑
RAA引物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及检测盖塔病毒的荧光RT
‑
RAA引物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]盖塔病毒(Getah virus,GETV)是披膜病毒科甲病毒属的人畜共患病病毒，正链RNA病毒。主要引起猪发生发烧、腹泻和繁殖障碍，导致马出现发热、皮疹和水肿等临床症状。在过去几年中，研究人员先后在野猪、蓝狐、牛等动物中分离到盖塔病毒，并且通过血清学调查发现，鸡和鸭血清内含有GETV特异性抗体，说明鸡和鸭也可能是盖塔病毒的感染宿主。
[0003]为了便于临床诊断和流行病学研究，需要建立一种快速有效的盖塔病毒检测方法。目前已经建立了多种方法用于GETV的临床检测，包括病毒分离、酶联免疫吸附试验、血清中和试验、RT
‑
PCR和RT
‑
qPCR等。病毒分离费时费力，血清学检测易与其他甲病毒属成员出现交叉反应，其他方法操作复杂并且需要昂贵的仪器。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何快速检测盖塔病毒或如何制备检测盖塔病毒的RT
‑
RAA试剂盒。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了基于荧光RT
‑
RAA用于检测盖塔病毒的试剂盒。所述试剂盒可包括检测盖塔病毒的组合物。所述组合物可包括引物RT
‑
RAA
‑
F2、RT
‑
>RAA
‑
R2和探针。所述引物RT
‑
RAA
‑
F2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述引物RT
‑
RAA
‑
R2的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探针的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。
[0006]上文所述试剂盒可为基于荧光RT
‑
RAA技术的试剂盒。
[0007]上文所述试剂盒中，所述探针可具有下述任一修饰或其组合：
[0008]A1)在序列表中序列4第31核苷酸上标记荧光基团；
[0009]A2)在序列表中序列4的第32位核苷酸标记淬灭基团；
[0010]A3)在序列表中序列4的第31位碱基和32位碱基中间用四氢呋喃修饰；
[0011]A4)在序列表中序列4的第46位核苷酸用C3
‑
spacer标记。
[0012]上文所述荧光基团可为I6FAM。所述四氢呋喃修饰基团可为dSpacer(IDSP)。所述淬灭基团可为IBHQ1。
[0013]上文所述试剂盒中，所述组合物还可包括RT荧光基础反应单元。所述RT荧光基础反应单元可包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和/或DNA聚合酶。所述RT荧光基础反应单元可来源于荧光型RT
‑
RAA核酸扩增试剂盒。所述RT荧光基础反应单元可为冻干粉。
[0014]上文所述试剂盒中，所述组合物还包括镁离子缓冲液。所述镁离子缓冲液可为醋酸镁(浓度280mmol/L)。
[0015]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了上文所述的检测盖塔病毒的组合物。
[0016]上文所述组合物的各组分可为液体和/或固体粉末。
[0017]上文所述组合物的各组分可为单独包装。
[0018]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了用于检测盖塔病毒的系统。所述系统可含有上文所述的试剂盒和荧光检测仪器。
[0019]上文所述系统可为基于荧光RT
‑
RAA技术的系统。所述荧光检测仪器可为荧光定量PCR仪。
[0020]上文所述的试剂盒和/或上文所述的组合物在盖塔病毒检测或辅助检测中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0021]上文所述应用中，所述检测或辅助检测的RT
‑
RAA反应条件可为39℃恒温反应30min。
[0022]上文所述的组合物在制备盖塔病毒检测或辅助检测产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0023]上文所述盖塔病毒可为猪盖塔病毒。
[0024]目前没有使用RAA检测GETV的报道。本专利技术首次建立了使用荧光RT
‑
RAA(reverse transcription recombinase
‑
aided amplification,反转录重组酶辅助扩增)检测GETV的试剂盒，与现有检测盖塔病毒的方法相比，该试剂盒能够快速高效的检测GETV，在39℃恒温反应30min即可完成检测，灵敏度为8拷贝/反应的GETV SC201807病毒质粒转录本和20TCID50/反应的GETV SC201807病毒RNA，特异性好，准确性高，可以为猪盖塔病毒的临床样品的检测提供技术支撑。
附图说明
[0025]图1为RT
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PCR结果：M为DL2000 Marker，1
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9为引物组合的RT
‑
PCR结果(1
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9依次为RT
‑
RAA
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F1/RT
‑
RAA
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R1，RT
‑
RAA
‑
F1/RT
‑
RAA
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R2，RT
‑
RAA
‑
F1/RT
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RAA
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R3，RT
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RAA
‑
F2/RT
‑
RAA
‑
R1，RT
‑
RAA
‑
F2/RT
‑
RAA
‑
R2，RT
‑
RAA
‑
F2/RT
‑
RAA
‑
R3，RT
‑
RAA
‑
F3/RT
‑
RAA
‑
R1，RT
‑
RAA
‑
F3/RT
‑
RAA
‑
R2，RT
‑
RAA
‑
F3/RT
‑
RAA
‑
R3)，10为阴性对照。
[0026]图2为引物筛选结果:
①‑⑨
为引物组合(
①
为RT
‑
RAA
‑
F1/RT
‑
RAA
‑
R1，
②
为RT
‑
RAA
‑
F1/RT
‑
RAA
‑
R2，
③
为RT
‑
RAA
‑
F1/RT
‑
RAA
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于荧光RT
‑
RAA用于检测盖塔病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测盖塔病毒的组合物；所述组合物包括引物RT
‑
RAA
‑
F2、RT
‑
RAA
‑
R2和探针；所述引物RT
‑
RAA
‑
F2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述引物RT
‑
RAA
‑
R2的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述探针的核苷酸序列如序列表中序列4所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针具有下述任一修饰或其组合：A1)在序列表中序列4第31核苷酸上标记荧光基团；A2)在序列表中序列4的第32位核苷酸标记淬灭基团；A3)在序列表中序列4的第31位碱基和32位碱基中间用四氢呋喃修饰；A4)在序列表中序列4的第46位核苷酸用C3
‑
spacer标记。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，周远成，朱玲，聂民财，邝山，
申请(专利权)人：畜科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：