脑类器官的制造方法技术

本发明专利技术提供一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；以及将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养的工序(c)；在白血病抑制因子(LIF)的存在进行上述工序(c)的至少一部分。分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脑类器官的制造方法


[0001]本专利技术涉及脑类器官的制造方法。更详细而言，本专利技术涉及具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法、具有淀粉样斑块的脑类器官、阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法。本申请基于2019年7月5日在日本提出申请的日本特愿2019－126266号主张优先权，并将其内容援引于本说明书中。

技术介绍

[0002]类器官是指细胞聚集而形成的小型的脏器，具有与生物体内的脏器类似的结构和功能。近年来，积极地进行了由多能干细胞制作各种类器官的研究，例如，制作了脑类器官、肠类器官、肝脏类器官、肾脏类器官等。
[0003]但是，阿尔茨海默病是不可逆的进行性的脑部疾病。在阿尔茨海默病患者的脑部确认到被称为淀粉样斑块的特征性的结构，已知淀粉样斑块的构成成分是被称为淀粉样蛋白β肽的肽。淀粉样蛋白β肽是将被称为β－淀粉样前体蛋白(amyloidprecusor protein)(APP)的前体蛋白切断而生成的由长度为36～43个氨基酸构成的肽。
[0004]为了开发阿尔茨海默病的治疗药，开发了一种阿尔茨海默病模型小鼠。然而，人与小鼠的脑部的结构不同，有时无法将通过阿尔茨海默病模型小鼠得到的见解应用于人。因此，寻求一种能够更可靠地重新阿尔茨海默病的病情且能够在体外使用的人脑类器官。例如，在非专利文献1中记载了由来自阿尔茨海默病患者的iPS细胞制作具有淀粉样斑块的脑类器官。
[0005]现有技术文献
[0006]非专利文献
[0007]非专利文献1：Gonzalez C.,et al.,Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids.,Mol Psychiatry,23(12),2363
‑
2374,2018.

技术实现思路

[0008]然而，非专利文献1中记载的脑类器官的制作方法在淀粉样斑块的形成效率方面有改良的余地。因此，本专利技术的目的在于提供高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官的技术。
[0009]本专利技术包含以下的方案。
[0010][1]一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体(Embryoid Body，EB)的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养的工序(c)；在白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor)(LIF)的存在下进行上述工序(c)的至少一部分。
[0011][2]根据[1]所述的制造方法，其中，在超过20体积％的氧的存在下进行上述工序
(c)的至少一部分。
[0012][3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，将上述工序(c)进行100天以上。
[0013][4]根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，在上述工序(a)之前，进一步包括将上述多能干细胞在小于100ng/mL的成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor)－2(FGF2)的存在下进行培养的工序。
[0014][5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，以无饲养物进行上述多能干细胞的培养。
[0015][6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，上述阿尔茨海默病相关基因为早老素(Presenilin)1(PS1)基因、早老素2(PS2)基因或β－淀粉样前体蛋白(APP)基因。
[0016][7]一种脑类器官，具有直径大于20μm的淀粉样斑块。
[0017][8]根据[7]所述的脑类器官，其中，在脑类器官的截面，每1个上述淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例的平均值为0.1％以上。
[0018][9]根据[7]或[8]所述的脑类器官，其中，相对于每1个脑类器官，上述淀粉样斑块的数量为2个以上。
[0019][10]根据[7]～[9]中任一项所述的脑类器官，其中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)为0.15以上。
[0020][11]根据[7]～[10]中任一项所述的脑类器官，是通过[1]～[6]中任一项所述的制造方法而制造的。
[0021][12]一种阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法，包括：在受试物质的存在下培养[7]～[10]中任一项所述的脑类器官的工序，以及测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序；上述淀粉样斑块的大小发生了缩小表示上述受试物质为阿尔茨海默病的治疗药。
[0022][13]一种阿尔茨海默病的预防药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及在将工序(c)进行100天以上后测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序(d)；在工序(d)中，上述淀粉样斑块的大小与对照相比发生了缩小表示上述受试物质为阿尔茨海默病的预防药。
[0023][14]一种阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及对工序(c)的上述脑类器官的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量进行定量的工序(d
’
)；在工序(d
’
)中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的比与对照相比发生了降低表示上述受试物质为阿尔茨海默病的预防药或治疗药。
[0024]根据本专利技术，能够提供一种高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官的技术。
附图说明
[0025]图1是表示实验例1中的脑类器官制作的进度表(schedule)的图。
[0026]图2中的(a)和(b)是表示实验例2中对于人脑类器官的淀粉样斑块进行检测而得的结果的显微镜照片。
[0027]图3是表示实验例2中直径20μm以上的每1个淀粉样斑块的面积相对于人脑类器官的截面的总面积的比例(％)的图表。
[0028]图4的(a)～(e)是表示实验例3中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序a，将工序a之后的所述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β即GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序b，以及将工序b之后的所述类器官从所述细胞外基质取出并在培养基中进行搅拌培养的工序c；在白血病抑制因子即LIF的存在下进行所述工序c的至少一部分。2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在超过20体积％的氧的存在下进行所述工序c的至少一部分。3.根据权利要求1或2所述的制造方法，将所述工序c进行100天以上。4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，在所述工序a之前，进一步包括将所述多能干细胞在小于100ng/mL的成纤维细胞生长因子－2即FGF2的存在下进行培养的工序。5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，以无饲养物进行所述多能干细胞的培养。6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述阿尔茨海默病相关基因为早老素1即PS1基因、早老素2即PS2基因或β－淀粉样前体蛋白即APP基因。7.一种脑类器官，具有直径大于20μm的淀粉样斑块。8.根据权利要求7所述的脑类器官，其中，在脑类器官的截面，每1个所述淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例的平均值为0.1％以上。9.根据权利要求7或8所述的脑类器官，其中，相对于每1个脑类器官，所述淀粉样斑块的数量为2个以上。10.根据权利要求7～9中任一项所述的脑类器官，其中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比即淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量为0.15以上。11.根据权利要求7～10中任一项所述的脑类器官，是通过权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：石井弘子，冈野荣之，
申请(专利权)人：学校法人庆应义塾，
类型：发明
国别省市：