用作连接剂的双(2-卤代乙酰胺基)-化合物以及包含抗体、半抗体和抗体片段的所得产物制造技术

描述了用作接头以化学交联多个硫醇基的双(2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作连接剂的双(2
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卤代乙酰胺基)
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化合物以及包含抗体、半抗体和抗体片段的所得产物


[0001]本专利技术涉及双(2
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卤代乙酰胺基)
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衍生物作为用于化学交联多个硫醇基的化合物的用途，并且特别地但非排他地，所述硫醇基是肽链中半胱氨酸氨基酸的硫醇基。
[0002]因此，本专利技术提供了用作连接化合物的芳基双(2
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卤代乙酰胺)
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化合物；具有与所述接头键合的硫醇基的抗体、半抗体和抗体片段缀合物，包含具有与所述接头键合的硫醇基的抗体、半抗体和抗体片段的产物(例如抗体
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蛋白质缀合物和抗体
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药物缀合物)，以及制备所述缀合物和产物的方法。

技术介绍

[0003]抗体药物缀合物(Antibody drug conjugate，ADC)是前沿的基于抗体的治疗方法之一。因此，其在过去二十年中引起了极大的关注。ADC包含单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，其用作将细胞毒性药物引导至特定恶性细胞或组织的载剂。ADC的构建需要特定的接头特征，以获得血浆稳定的抗体药物缀合物。
[0004]第一代ADC的构建利用了抗体内氨基酸残基的固有亲核官能团，主要是半胱氨酸和赖氨酸氨基酸。为了产生基于半胱氨酸的缀合物，需要链间二硫键的预还原步骤。免疫球蛋白G抗体(IgG)的IgG1亚类是人血清中最丰富的一种，并且是在基于mAb的治疗中采用的最常见的类型。IgG1总计有四个链间二硫键，两个链间二硫键在重链/轻链(HC/LC)之间且两个链间二硫键在铰链区的重链/重链(HC/HC)之间。
[0005]大量研究已表明了4个链间二硫键的重要性，其不仅维持mAb的结构和最佳的抗原结合，还保留mAb的效应子功能。当测试缺乏重链间二硫键的突变IgG时，观察到嵌合小鼠/人IgG的补体依赖性细胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Antibody
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Dependent Cell
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Mediated Cytotoxicity，ADCC)降低。
[0006]已经发现，即使IgG的四个链间二硫键的部分降低也会导致其补体结合(complement fixation)功能和CDC显著降低，而半抗体的有用性也越来越被认可。
[0007]鉴于二硫键对于维持mAb的正确折叠、结构以及，更重要地，对于维持其功能至关重要，因此在构建mAb缀合物之前维持重组抗体的还原后结构是必不可少的。为了避免对mAb进行复杂且昂贵的遗传再工程化以保持mAb的还原后结构并保留明确的缀合方法，Abzena开创了新的方法(技术)，其基于对经还原的链间二硫键的重新桥连产生均质且稳定的ADC。
[0008]技术是基于双砜的试剂，其将mAb的经还原链间二硫键重新退火形成3碳桥，并且通过这样做，保持了抗体的还原后二硫键结构。通过顺序加成
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消除机制将可接近的经还原二硫键交联：首先通过迈克尔加成经还原二硫键的硫醇基，然后消除对甲苯亚磺酸生成第二迈克尔受体(α
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β不饱和羰基)。然后，邻位硫醇盐根基团通过第二次迈克尔加成进行反应，在两个半胱氨酸硫醇之间形成3
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碳键。
[0009]鉴于使用双砜接头的主要目的是获得更好的ADC血浆稳定性，因此通过将经荧光标记的使用马来酰亚胺键的曲妥珠单抗与经荧光标记的双烷基化曲妥珠单抗进行比较来评估提高的血浆稳定性。在存在高浓度白蛋白的情况下，后者在5天内表现出显著的血清稳定性(与马来酰亚胺连接的抗体相比)。
[0010]此外，已经证实，在构建曲妥珠单抗的ADC中，使用带有单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)的双砜试剂完全保留了曲妥珠单抗与HER2受体的结合活性，并在HER2阳性细胞系中表现出强效的抗增殖活性。
[0011]双反应性马来酰亚胺接头已被开发为通过2
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碳桥的二硫再桥连剂(rebridging agent)以实现双硫代琥珀酰胺键。与双砜衍生物相比，双反应性马来酰亚胺衍生物的快速反应动力学提供了更高的蛋白质结构完整性和更宽的反应pH范围(6至8)。
[0012]认为双砜试剂和二溴亚胺衍生物对于经还原二硫化物是最早和最成熟的再桥连剂。尽管如此，每个都有相关的缺点。这些缺点包括试剂的水溶性差以及在还原条件下还原的二硫键和未配对的半胱氨酸残基之间的选择性缺乏。重链
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轻链和重链
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重链二者都可发生桥连，导致产物的混合。
[0013]因此，有兴趣寻找另外的接头来替代抗体中的硫桥。
[0014]其他实例支架包括基于哒嗪二酮的化合物，例如二溴哒嗪二酮，其通过2
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碳桥交联二硫键。Di
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TCEP取代的二硫酚哒嗪二酮也已被使用，并且可同时作为还原剂和稳定的交联接头发挥作用。其他方法已将可点击化学(clickable chemistry)引入基于哒嗪二酮的接头，以允许包含另外的官能团。
[0015]EP3335734涉及与可用于通过置换离去基团以形成硫醚来形成抗药物缀合物的接头连接的药物部分的用途。例如，奥瑞他汀E(MMAE)和奥瑞他汀F通过酰胺偶联与接头连接。公开了赫赛汀
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接头
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药物单元。
[0016]认为重桥连策略是精妙的方法，其能够将反应性官能团引入经还原的mAb，同时保持其明确限定的还原后结构。尽管最近在该领域取得了进展并进行了大量研究工作，但上述通过形成2碳和3碳桥的重桥连方法仍然存在需要进一步解决的实际局限性。这些局限性包括低产率和正在产生的产物的混合。
[0017]鉴于上述考虑，设计了本专利技术。

技术实现思路

[0018]本专利技术提供了芳基双(2
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卤代乙酰胺基)
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衍生物作为下一代重桥连剂。这些双卤代乙酰胺衍生物在如上所述的常规重桥连中具有效用，但在全mAb的异重桥连(两个或多个不同重桥连接头的连接)和半抗体缀合物的产生中可能特别有用。
[0019]由于所有主要重点都放在将重链
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轻链和重链
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重链链间二硫键完全交联以获得完全交联的抗体(150KDa)，先前描述的(参见背景)重桥连方法忽略了构建半抗体(75KDa)作为预期产物的潜在优势。例如，半抗体可在内体循环和肿瘤渗透中具有效用。另外，据本专利技术人所知，先前的重桥连方法在重
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重二硫键和重
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轻二硫键之间未显示出显著的选择性。因此，获得异双官能mAb的位点选择性蛋白质标记是先前未解决的挑战。
[0020]本专利技术的目的是解决这些问题。
[0021]接头化合物
[0022]在第一方面，本专利技术提供了带有双本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.式(I)的接头化合物或其盐：其中每个X独立地是F、Cl、Br或I；R1是H、COOR
A
、CONH2、CONHR
A
、CONR
A2
、CONHL或CONR
A
L；L，如果存在，则是以反应性基团R3封端的链；每个R
A
，如果存在，则独立地选自C1‑4烷基；n是0、1、2或3；并且每个R2，如果存在，则独立地选自F、Cl、Me、CF3、OMe和OCF3，或者R2是如对R1所限定的基团。2.权利要求1所述的化合物，其中L是以R3封端的聚醚或聚硫醚，并且R3选自N3、包含C≡C键的基团、受保护的胺、离去基团和式(H)的部分：其中每个X独立地是F、Cl、Br或I；N是0、1、2或3；并且每个R2，如果存在，则独立地选自F、Cl、Me、CF3、OMe和OCF3，或者R2是如权利要求1中对R1所限定的基团。3.权利要求1或2所述的化合物，其中n是0。4.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X是Br或I。5.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(IIa)、(IIb)或(IIc)：
其中X是Br或I；并且R1是H、COOMe、CONH2或CONHL。6.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(IVa)、(IVb)或(IVc)其中所述化合物具有式(IVa)、(IVb)或(IVc)任选地，其中：每个X是Br；或每个X是I；或
两个X一个亚芳基是Br，并且两个X或另一个亚芳基是I。7.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自实例(1)至(18)：其中所述化合物选自实例(1)至(18)：8.半抗体，其包含在铰链区的重链
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重链半胱氨酸残基间桥连的接头残基，其中所述接头残基是如前述权利要求中任一项所限定的部分，其中两个X被硫醇基置换。9.包含桥连重链和轻链的接头残基的单官能化抗体，其中所述接头残基是如权利要求1至7中任一项所限定的部分，其中两个X被硫醇基置换。
10.硫桥连fab抗体片段，其包含接头残基，所述接头残基是如权利要求1至7中任一项所限定的部分，其中两个X被硫醇基置换。11.权利要求10所述的硫桥连fab抗体片段，其中所述接头残基是式(IXa)、(IXb)、(IXc)或(IXd)的部分：其中X是Br或I；并且
其中m选自3、4、5、6、7、8、9和10，并且表示与蛋白质链的连接点。12.用于产生包含桥连重链和轻链的接头残基的单官能化抗体的方法，其中所述接头残基是式(Ia)的部分，其中两个X被硫醇基置换，所述方法包括用约1至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁，
申请(专利权)人：巴斯大学，
类型：发明
国别省市：