多核苷酸文库制造技术

双链(ds)多核苷酸文库成员的文库，其长度是至少12bp，包含多种多核苷酸核心序列和相同的突出端。的突出端。的突出端。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多核苷酸文库


[0001]本专利技术涉及包含多种多核苷酸序列、长度至少50bp的双链(ds)多核苷酸文库成员的文库，以及使用多样性寡核苷酸(oligonucleotide)文库合成双链(ds)多核苷酸文库的方法。

技术介绍

[0002]多核苷酸的人工合成目前通过两种不一定排斥的方法来实现：
[0003]多核苷酸合成的第一类方法是“化学合成法”。这是一种通过利用亚磷酰胺化学依次连接核苷酸来构建单链DNA(或RNA)分子的方法(Beaucage and Caruthers,1981)。这种方法可以构建具有任何复杂性、特定的、预先确定的模板序列的DNA分子。化学方法因其成本低、易于平行化而广受欢迎，并且在某些实施中允许在芯片中高通量生产DNA或RNA(LeProust et al.,2010)。这些方法的主要和最大缺点是反应的产量随合成模板的长度增加而急剧下降，从而通常将分子的大小限制在大约200个碱基对(bp或bps)。
[0004]DNA合成的第二类方法是“组装方法”，它包括以特定方式生化连接不同大小和不同序列的寡核苷酸和多核苷酸，从而获得具有所需目标序列的更大分子。这些寡核苷酸的来源通常是化学合成，但也可以是天然存在的DNA的酶消化产物。这些组装方法通常以产品名称“基因合成”进行商业化，术语“基因合成”是合成较大但不一定具有基因大小长度的多核苷酸链(1K
‑
5K bp)的换喻词。文献中报道了将较小的多核苷酸组装成目标序列的几种方法(Stemmer et al.,1995；Smith et al.,2003；Engler et al.,2008；Gibson et al.,2009；Horspool 2010)。
[0005]在过去几年中，“Gibson组装”(Gibson et al.,2009)已成为连接多个线性ds DNA片段(大小范围从大约30bp到数个Kbp)的流行方法。该方法包括连接许多具有成对重叠序列同源性的ds DNA片段。片段之间的重叠同源区范围可介于大约15至80bp之间。不需要突出端，因为该方法的酶促机制负责产生突出端、补平间隙并正确连接片段。这种酶促机制采用三种酶：T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶，这三种酶都在等温反应中使用。这种方法简单通用，可以生产线性和环状ds DNA产物。这种方法的缺点是其对自动化的限制，不适合大规模商业使用。
[0006]构建具有数千个碱基对的DNA分子的共同主题是化学合成高达几百个核苷酸或碱基对的小片段，然后通过克隆、连接、PCA或Gibson组装将这些片段连接在一起。
[0007]一些方法表明可能通过化学合成预先构建涵盖可能遗传空间或其所需子集的寡核苷酸的文库。
[0008]Chari和Church建议采用合成的寡核苷酸(200个碱基)产生短DNA片段，并在酵母和大肠杆菌中使用体内同源重组组装成大的DNA片段(Chari and Church,2017)。
[0009]WO 2009/138954A2公开了一种通过固相组装合成较大多核苷酸的方法，其中根据需要化学合成较大多核苷酸组装所需的规定亚基。
[0010]Pedersen等人(US2016/0215316A1)建议使用包含所有可能六聚体空间的文库(N
＝4096个寡核苷酸)。然后，使用寡核苷酸接头组装六个碱基对长的寡核苷酸，从而形成多核苷酸。寡核苷酸的串联和大规模DNA合成存在一定的局限性。由于需要适当设计的文库和手动方案(例如克隆)、使用大量试剂，因此这些方法非常耗时。这些反过来又大幅增加了合成成本，随着目标序列长度增加，每bp的成本增加。
[0011]WO2002/081490公开了一种根据数据库(例如人类基因组数据库)中可用的信息，通过计算机指导多核苷酸组装，利用基因组序列信息结果的方法。具体地，它公开了一种产生目标多核苷酸的方法，其中通过计算机程序将目标多核苷酸解析为一系列连续的寡核苷酸，所述目标多核苷酸是通过以单向或双向方式将从头合成的寡核苷酸顺序添加到起始寡核苷酸中而产生的。
[0012]WO2004/033619还公开了一种利用基因组序列信息的结果进行计算机指导的多核苷酸组装的方法。
[0013]WO99/14318公开了一种使用具有互补序列和突出端的寡核苷酸重叠对产生目标多核苷酸的方法。寡核苷酸依次退火以产生双链DNA片段。
[0014]WO2019/073072公开了一种使用短寡核苷酸的多样性文库合成具有预定序列的双链多核苷酸的方法。
[0015]WO2013/017950公开了一种用于组装和克隆多核苷酸的方法，其使用包括在固体载体上顺序组装多核苷酸分子的方法。
[0016]WO2012/084923公开了一种具有不同长度多核苷酸片段的文库，以鉴定具有改进特性的片段。
[0017]尽管最近几年合成DNA的技术取得了长足的进步，但在DNA体积、通量、纯度，特别长度方面仍然存在严格的限制。

技术实现思路

[0018]本专利技术的目的是提供合成多种双链(ds)多核苷酸的改进方法和工具。
[0019]所述目的由本专利技术权利要求的主题解决，并在本文中进一步描述。
[0020]根据本专利技术，提供了包含多种多核苷酸核心序列和相同突出端的至少12bp长度的双链(ds)多核苷酸文库成员的文库。
[0021]具体地，所述突出端彼此不同。
[0022]具体地，所述突出端彼此不互补。
[0023]具体地，每个文库成员包含相同的第一突出端序列和相同的第二突出端序列。具体地，所述第一突出端序列和第二突出端序列彼此不互补。
[0024]根据一个具体实施方案，所述突出端在前导链和后随链上，并且其中每个文库成员包含：
[0025]a)相同的第一突出端序列，即前导链(leading strand)的5
’
突出端，以及相同的第二突出端序列，即后随链(lagging strand)的5
’
突出端；或者
[0026]b)相同的第一突出端序列，即前导链的3
’
突出端，以及相同的第二突出端序列，即后随链的3
’
突出端；
[0027]其中所述第一突出端序列和第二突出端序列彼此不互补。
[0028]有利的是，本文所描述的多种ds多核苷酸可以一起合并和处理，因为它们包含不
互补的相同突出端。因此，避免了不同文库成员的退火和连接。
[0029]具体地，每个文库成员的长度是至少12、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个bp，高达320、350、380、400、500、600、700、800、900、1000或2000个碱基对或甚至更多个bp。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.双链(ds)多核苷酸文库成员的文库，其长度至少为12bp，包含多种多核苷酸核心序列和相同的突出端。2.根据权利要求1所述的文库，其中所述突出端在前导链和后随链上，并且其中每个文库成员包含：a)相同的第一突出端序列，即前导链的5
’
突出端，以及相同的第二突出端序列，即后随链的5
’
突出端；或者b)相同的第一突出端序列，即前导链的3
’
突出端，以及相同的第二突出端序列，即后随链的3
’
突出端；其中所述第一突出端序列和第二突出端序列彼此不互补。3.根据权利要求1或2所述的文库，其中所述突出端的长度是4
‑
8个核苷酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的文库，其中每个所述文库成员包含选自由以下项组成的组的相同修饰：磷酸化、甲基化、生物素化或与荧光团或猝灭剂的连接。5.根据权利要求1至4中任一项所述的文库，其中所述文库成员包含在一个文库容器中，或包含在多个空间上不同的文库容器中。6.根据权利要求1至5中任一项所述的文库，其中每一个所述文库成员包含与模板至少30％相同的序列。7.权利要求1至6中任一项所述文库的产生方法，包括以下步骤：a)提供模板核苷酸序列；和b)合成多种长度至少是12bp的双链(ds)多核苷酸，该多核苷酸包含多样性的核心序列并包含相同的非互补突出端，其中每个所述ds多核苷酸与所述模板至少30％相同，从而获得ds多核苷酸文库成员的文库。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述ds多核苷酸通过聚合酶链反应(PCR)富集。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中多种ds多核苷酸通过以下方式合成：部分退火匹配的单链寡核苷酸(ss寡核苷酸)的文库，从而获得每个都具有相同突出端的双链寡核苷酸(ds寡核苷酸)的第一文库，并且任选进一步与具有与第一文库的突出端匹配的突出端的ds寡核苷酸退火，从而获得ds寡核苷酸的第二文库。10.根据权利要求9所述的方法，其中：a)ss寡核苷酸文库包含长度至少是6nt的ss寡核苷酸；和/或b)ds寡核苷酸第一文库包含长度至少是6bp的ds寡核苷酸；和/或c)ds寡核苷酸第二文库包含长度至少是12bp的ds寡核苷酸。11.权利要求1至6中任一项所述文库在合成多种目标ds多核苷酸的方法中的用途，其中通过将所述文库成员与具有与所述文库成员的突出端匹配的突出端的ds寡核苷酸组装，使每个目标ds多核苷酸都比所述文库成员长，从而得到目标ds多核苷酸的文库。12.合成权利要求1至6中任一项文库的方法，所述文库包括多种目标ds多核苷酸，所述方法包括以下步骤：a)在阵列装置内提供包含多样性寡核苷酸文库成员的寡核苷酸文库，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：里本生物实验室有限责任公司，
类型：发明
国别省市：