一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于PHA合成技术领域，具体提供了一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用，所述的启动子包含PhaR的结合位点，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种表达载体，该表达载体包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了包含该表达载体的重组菌，利用该重组菌可以联产PHA与其他产物。物。物。

【技术实现步骤摘要】
一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及PHA合成
，具体涉及一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用。

技术介绍

[0002]PHA是一种能够在许多细菌胞内合成并累积的高分子聚酯，在提取加工后，其性质可以类比于聚乙烯和聚苯乙烯，有潜力作为石油基塑料替代品。同时，由于其生物来源的特点，PHA也能够被自然界的微生物降解，开发其作为塑料制品可以解决白色污染和微塑料等环境保护问题。根据其组成单体不同，PHA有着不同的材料性能，从而可以应用在包装材料，医疗器械，有机农业，先进材料等方面。PHA根据其组成单体不同，可以分为单体碳链长度6个碳以下的短链PHA，如聚3
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羟基丁酸酯（P3HB），聚4
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羟基丁酸酯（P4HB），聚3
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羟基戊酸酯（P3HV）；或由碳链长度6个碳及以上的单体组成的中长链PHA，如聚3
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羟基己酸酯（P3HHx）等。
[0003]PHA作为一种来源于生物发酵的胞内产物，发展其和其他胞外产物的联产发酵是降低发酵成本，提升发酵产品价值的重要策略。常见的联产产物包括氨基酸、肌醇，四氢嘧啶、1,3
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丙二醇，3
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羟基丙酸、1,5
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戊二胺、5
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氨基乙酰丙酸（ALA）等。
[0004]在细菌中生产各类分泌酶，可以扩展其对不同底物的适应性，发展其利用廉价碳源的能力，降低工业生产成本。设计能够同步于发酵过程生产分泌酶对优化发酵条件，提升发酵效果有一定的意义。
[0005]PHA作为一种胞内产物，其发酵的产品量会受到细胞体积的影响。能够同步于发酵增加细胞体积的量会生产PHA有一定的促进作用。调整细胞体积的相关基因往往和细胞分裂密切相关，过早的调控这些基因表达会影响到细胞的分裂和增殖，进而影响到终产物的产量。所以调控这些基因在后期进行表达，具有一定的意义。
[0006]在细菌发酵后期，很多启动子的表达将逐渐趋于弱化。然而在实际的生产过程中，需要在后期有大量菌体量的时候大量表达，这样能够显著的提升最终产品的产量。PhaP蛋白是PHA颗粒结合蛋白，其表达量和PHA的合成直接相关，这促使其能够在PHA合成的过程中逐步表达，并不因为发酵的进行而逐渐减弱。因此，利用phaP启动子可以开发为一个后期表达量高的表达工具。
[0007]同时，在发酵后期，也可以通过联用该启动子和各类调控因子表达元件，实现发酵后期对于特定基因的抑制效果，提高主产物的产量。

技术实现思路

[0008]为提升现有的PHA发酵过程，降低发酵成本，本专利技术提供了一种启动子，其表达强度受PHA的合成调控，即随着PHA的累积该启动子的强度逐渐增强。将该启动子制备成表达载体，可以同步合成PHA与其他相关产物例如与PHA合成相关的产物、酶以及与细胞形变相
关的产物。采用本申请所述的启动子或表达载体构建重组菌可以使得重组菌提高自身生存能力以及合成产物的能力。具体的，本专利技术的第一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含启动子和编码PhaR（PHA颗粒调控蛋白）的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点。
[0009]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或者其为SEQ ID NO：5的突变体。
[0010]所述的启动子可以选自现有技术中常规的启动子，只要该启动子包含PhaR的结合位点，且具有启动子的活性。优选的，所述的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin
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R，所述的porin
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R为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点。
[0011]优选的，porin启动子突变体包括但不限于porin
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203、porin
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211、porin
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42或porin
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140中的任一种。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP1，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或者包含与SEQ ID NO：1具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP2，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2或者包含与SEQ ID NO：2具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
[0014]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP3，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或者包含与SEQ ID NO：3具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
[0015]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的启动子为porin
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R，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6或者包含与SEQ ID NO：6具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
[0016]所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
[0017]优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
[0018]优选的，所述的表达载体为质粒。
[0019]优选的，所述的表达载体还包含编码产物合成途径相关的基因。
[0020]所述的产物包含PHA或组成PHA的单体。其中，所述的PHA选自3
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羟基丁酸均聚物PHB，3
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羟基丁酸和4
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羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3
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羟基丁酸、4
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羟基丁酸和3
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羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3
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羟基丁酸和3
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羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3
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羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3
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羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3
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羟基丙酸的共聚物为P(3HB
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co
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3HP)或PHBHP；所述的组成PHA的单体选自3
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羟基丁酰辅酶A、4
‑
羟基丁酰辅酶A、3
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羟基戊酰辅酶A、5
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羟基戊酰辅酶A、3
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羟基己酰辅酶A或6
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羟基己酰辅酶A。
[0021]所述的产物包含：a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3
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丙二醇、3
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羟基丙酸、1，5
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戊二胺或5
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氨基乙酰丙酸；b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin
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R，所述的porin
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R为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点，其中，porin启动子突变体选自porin
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203、porin
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211、porin
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42或porin
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140中的任一种。3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体还包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物包含PHA或组成PHA的单体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的PHA选自3
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羟基丁酸均聚物PHB，3
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羟基丁酸和4
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羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3
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羟基丁酸、4
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羟基丁酸和3
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羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3
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羟基丁酸和3
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羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3
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羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3
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羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3
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羟基丙酸的共聚物为P(3HB
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co
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3HP)或PHBHP；所述的组成PHA的单体选自3
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羟基丁酰辅酶A、4
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羟基丁酰辅酶A、3
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羟基戊酰辅酶A、5
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羟基戊酰辅酶A、3
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羟基己酰辅酶A或6
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羟基己酰辅酶A。5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的产物还包含：a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3
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丙二醇、3
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羟基丙酸、1，5
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戊二胺或5
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氨基乙酰丙酸；b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，d）与细胞内基因调控相关的蛋白，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI或四环素操纵子阻遏蛋白TetR。6.一种表达载体组合物，其特征在于，所述的表达载体组合物包含一个或多个第一表达载体和一个或多个第二表达载体，所述的第一表达载体包含第一启动子，所述的第二表达载体包含第二启动子，所述的第一启动子和/或第二启动子包含PhaR的结合位点，所述的第一表达载体和/或第二表达载体包含编码PhaR的核苷酸序列，其中，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的表达载体组合物，其特征在于，所述包含PhaR的结合位点的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin
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R，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，刘絮，郑陶然，吴赴清，
申请(专利权)人：北京微构工场生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：