一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术中是以刺糖多孢菌QL

【技术实现步骤摘要】
一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用，属于生物


技术介绍

[0002]多杀菌素是从刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中提取得到的一种大环内酯类生物杀虫剂，具有无公害、高效、低毒、易降解等特点。它对非靶标动物无害，对哺乳动物也无致癌作用。多杀菌素是一种混合物，在该混合物中，多杀菌素A和D是主要组分并且对关键昆虫目标具有最高活性。多杀菌素J和L(多杀菌素混合物中的两种次要组分)是乙基多杀菌素(第二代多杀菌素杀虫剂)的前体。乙基多杀菌素是5,6
‑
二氢
‑3’‑
乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3
’‑
乙氧基多杀菌素L的混合物(参见说明书附图图1)，其是从多杀菌素J/L进行乙基化和氢化两步化学合成得到的，因此，能够高产多杀菌素J/L的发酵菌株是工业化生产乙基多杀菌素的关键。从多杀菌素生物合成途径分析，将spnK基因失活后，代谢流会发生改变，多杀菌素的发酵菌株将积累更多的多杀菌素J/L，而不是多杀菌素A/D，从而就可以得到大量的合成乙基多杀菌素的前体。
[0003]中国专利文献CN103119152A公开了修饰spnK基因以消除其表达的3
’‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法，利用基因工程同源重组或是通过诱变或利用RNA干扰技术(RNAi)对spnK基因进行修饰使其失活，从而得到多杀菌素J/L的生产菌株。然而，这几种方法均存在各种缺陷：通过同源重组使spnK失活，需要两步筛选，效率非常低；通过诱变筛选得到spnK的基因突变株，需要更大规模的筛选，而且专一性差；RNAi无法完全抑制基因的转录或翻译，并且容易脱靶导致假阳性或假阴性结果。
[0004]CRISPR/Cas是新一代的基因组定点编辑技术，能对活细胞DNA进行精准操作，实现基因片段的特异性插入，删除，替换等，利用CRISPR/Cas技术可以改变基因的序列和功能，控制细胞的命运和生命特征，为遗传性疾病的治疗提供新的方法。CRISPR/Cas系统存在于几乎所有的古菌和大多数细菌中。CRISPR/Cas由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，后者由一段前导序列、许多重复序列和间隔序列顺序排列组成。根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和
Ⅴ
型。目前研究得最为清楚的CRISPR/Cas9为2类Ⅱ型CRISPR系统，2015年张锋小组新发现的CRISPR/Cpf1属于2类
Ⅴ
型CRISPR系统。其中Ⅱ类系统是目前使用最多且最简单的RNA指导核酸内切酶技术，该系统主要包含两个成分：sgRNA和Cas9，其中sgRNA(single
‑
guide RNA)是由细菌的内源性CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans
‑
activating CRISPR RNA，tracrRNA)融合而成的人工合成RNA，主要发挥引导作用；Cas9由HNH和RuvC两个核酸酶结构域组成，可完成对外源DNA序列的识别和切割。
[0005]近年来，Cpf1酶的基因编辑技术迅速发展，由于其具有更高水平的靶标特异性，
Cpf1酶成为了应用于较多宿主的基因编辑工具。Cpf1是一种V型的II类CRISPR内切核酸酶，其除了具有DNA切割活性外，还具有RNA酶活性，可以将CRISPR RNA(crRNA)共转录物加工成独立的成熟crRNA。此外，与Cas9不同的是，Cpf1识别位于靶序列5
’
端富含胸腺嘧啶(T)的PAM(原间隔序列临近基序，Protospacer
‑
Adjacent Motif，简称PAM)序列，而Cas9则识别位于靶序列的3
’
端的富含鸟嘌呤(G)的PAM序列(5
’‑
NGG
‑3’
)。Cpf1识别的PAM序列与Cas9不同，极大地扩宽了CRISPR系统基因组编辑的靶点范围，尤其是富含AT的基因组。CRISPR/Cpf1的开发有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制，因此被称为是新一代的CRISPR基因组编辑工具。失去DNase酶活性的Cpf1(DNase
‑
dead Cpf1，ddCpf1)，仍保留了加工pre
‑
crRNA的功能。将作为基因工程表达调控元件的ddCpf1引入合成生物学研究领域可以更精准地靶向目的基因，也具有更强大的调控功能。与CRISPR/dCas9类似，在应用CRISPR/ddcpf1时，crRNA的靶向位置与其调控基因表达的能力有着明显关联，同样也可以通过选择不同的靶位点来控制基因调控的强度。
[0006]CRISPR/ddCpf1系统中的ddCpf1蛋白分子量相对较大，对宿主细胞的代谢是一种较大的负担，因此，它们能否在特定宿主细胞中进行表达是难以预期的。也有另外的可能性是，其虽然可以在宿主细胞中表达但所表达的ddCpf1蛋白没有功能。因此，CRISPR/ddCpf1系统能否应用于特定的宿主环境是需要进行试验和探索的，目前，现有技术中还没有检索该技术的应用。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高产多杀菌素J/L的工程菌及其构建方法与应用。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种高产多杀菌素J/L的工程菌，所述工程菌是以刺糖多孢菌QL
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1为出发菌株，通过插入crRNA抑制刺糖多孢菌QL
‑
1的spnK基因表达至失活，构建得到。
[0010]根据本专利技术优选的，所述spnK基因如SEQ ID NO.1所示，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
[0011]上述高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，是以spnK基因作为靶基因，采用CRISPR/ddCpf1技术设计抑制刺糖多孢菌QL
‑
1的spnK基因表达的crRNA，然后将crRNA连接至表达质粒上，再转化大肠杆菌得到大肠杆菌转化子，最后将大肠杆菌转化子接合转移至刺糖多孢菌中，检测发酵产物后获得。
[0012]根据本专利技术优选的，所述高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，具体步骤如下：
[0013](1)以spnK基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索Cpf1的原间隔序列临近基序识别靶基因序列的TTTN或TTN，选取原间隔序列临近基序之后的23个核苷酸为原间隔序列，即得到抑制刺糖多孢菌QL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产多杀菌素J/L的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以刺糖多孢菌QL
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1为出发菌株，通过插入crRNA抑制刺糖多孢菌QL
‑
1的spnK基因表达至失活，构建得到。2.如权利要求1所述的高产多杀菌素J/L的工程菌，其特征在于，所述spnK基因如SEQ ID NO.1所示，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。3.权利要求1所述的高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，其特征在于，是以spnK基因作为靶基因，采用CRISPR/ddCpf1技术设计抑制刺糖多孢菌QL
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1的spnK基因表达的crRNA，然后将crRNA连接至表达质粒上，再转化大肠杆菌得到大肠杆菌转化子，最后将大肠杆菌转化子接合转移至刺糖多孢菌中，检测发酵产物后获得。4.如权利要求3所述的高产多杀菌素J/L的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)以spnK基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索Cpf1的原间隔序列临近基序识别靶基因序列的TTTN或TTN，选取原间隔序列临近基序之后的23个核苷酸为原间隔序列，即得到抑制刺糖多孢菌QL
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1的spnK基因表达的crRNA；(2)采用直接合成法或引物退火法将步骤(1)所述crRNA连接到含有ddCpf1编码基因的质粒载体pQL
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2上，得到重组质粒pQL
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spnK
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crRNA；(3)将构建好的重组质粒pQL
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spnK
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crRNA转化大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌转化子菌液；(4)将大肠杆菌转化子菌液与刺糖多孢菌的菌丝悬液混合后涂R6平板培养基，培养6～10天后选择接合子进行培养，经筛选后获得高产多杀菌素J/L的基因工程菌，记为QL
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1/pQL
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spnK
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crRNA。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述直接合成法的具体步骤如下：按照crRNA的序列采用同源重组方法合成含有crRNA的插入序列(含有SpeI酶切位点)，再将含有crRNA的插入序列连接至质粒载体pQL
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2的speI酶切位点处，得到重组质粒pQL
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spnK
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crRNA。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引物退火法的具体步骤如下：以crRNA为模板进行PCR扩增，得到crRNA序列，所述PCR扩增的引物序列如下：crRNA
‑
F：5
′‑
atttctactgttgtagatNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNactagtgcgtcgatatct
‑3′
；crRNA
‑
R：5
′‑
agatatcgacgcactagtNNNNNNNNNN...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄科学，何天景，翟晓云，刘家亨，
申请(专利权)人：齐鲁制药内蒙古有限公司，
类型：发明
国别省市：