一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用技术

本发明专利技术提供一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用，该筛选方法，包括：(1)由橡胶树白粉菌基因中选取潜在效应蛋白的编码基因A；(2)构建橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体，在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A，得炭疽菌转化子；(3)将效应蛋白表达程度高的炭疽菌转化子培养，接种至离体的橡胶叶片，测定其致病能力；若相比野生型，胶孢炭疽菌转化子的致病力下降，则表明该效应蛋白编码基因A为无毒基因。本发明专利技术的筛选方法，可直接通过不同效应蛋白基因转化子的致病力筛选出白粉菌无毒基因，实现橡胶树白粉菌无毒基因的更加快速地筛选和鉴定，有利于加强橡胶白粉病的防控以及抗病品种选育。粉病的防控以及抗病品种选育。粉病的防控以及抗病品种选育。

【技术实现步骤摘要】
一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用


[0001]本专利技术涉及微生物基因工程
，特别涉及一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用。

技术介绍

[0002]白粉菌为植物白粉病的病原真菌，在重要粮食作物和经济作物上可引起严重的产量损失。橡胶树白粉病是橡胶树一种常见的叶部病害，橡胶树白粉菌侵染重要经济作物巴西橡胶树，影响橡胶树生长，引起天然橡胶的产量明显下降。而目前对于橡胶树白粉菌的遗传多样性领域的研究仍旧较少。
[0003]无毒基因一般编码为病原物分泌的能触发植物抗性反应的蛋白。现有在麦白粉中，已鉴定了白粉菌为专性活体寄生，并且发掘了多个小麦白粉菌无毒基因，这对指导作物抗病品种的选育具有较大意义。但在橡胶树白粉菌的无毒基因还未被报道，由于橡胶白粉菌本身无法进行基因操作或外源转化，其受技术的限制，现有仍未能对白粉菌建立可靠的遗传操作技术，而且巴西橡胶树遗传操作的难度大，较大地限制了橡胶树抗病品种选育的发展，因此，寻找一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，有利于为建立橡胶白粉病的防控体系以及抗病品种的选育提供重要的技术支持。

技术实现思路

[0004]鉴以此，本专利技术提出一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用，能够有效实现了对橡胶树白粉菌无毒基因的筛选和鉴定。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1：由橡胶树白粉菌基因中选取潜在效应蛋白的编码基因A；
[0008]步骤2：构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体，并通过在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A，得到炭疽菌转化子；
[0009]步骤3：根据测定的效应蛋白设计PCR引物，以及利用定量PCR检测效应蛋白在菌株中的表达量，得到效应蛋白表达程度高的炭疽菌转化子，培养，收集分生孢子，并接种至离体的橡胶叶片上，测定炭疽菌转化子的致病能力；
[0010]步骤4：以野生型胶孢炭疽菌作为对照；若相比野生型，胶孢炭疽菌转化子的致病力下降，则表明转化的白粉菌效应蛋白触发了橡胶树的抗病性，该效应蛋白编码基因A为无毒基因。
[0011]进一步说明，步骤2中，所述构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体的方法为，将白粉菌效应蛋白编码基因cDNA序列克隆至含有T7启动子和遗传霉素G418抗性基因的pFL2真菌表达载体中，将该白粉菌效应蛋白编码基因插入在3
×
HA标签之前，在胶孢炭疽菌核糖体蛋白的组成型启动子CgRP60之后，得到橡胶树白粉菌效应蛋白的表达载体。
[0012]进一步说明，所述CgRP60启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]进一步说明，所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]进一步说明，所述G418抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]进一步说明，所述3
×
HA标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]进一步说明，所述在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A的方法为采用PEG介导的原生质体转化法。
[0017]一种根据上述橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法筛选而得的橡胶树白粉菌无毒基因，该无毒基因的效应蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0018]一种根据上述橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法筛选而得的橡胶树白粉菌无毒基因在防治橡胶树白粉菌病中的应用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020](1)本专利技术主要通过在胶孢炭疽菌中实现了橡胶白粉菌的潜在效应蛋白的编码基因进行转化表达，并在有效构建白粉菌效应蛋白基因表达载体的基础上，实现白粉菌的潜在分泌蛋白基因的有效转化表达，确保转化子白粉菌效应蛋白基因的表达结果，并经过炭疽菌转化子的筛选，用于接种至橡胶叶片中，直接以野生型胶孢炭疽菌作为对照，即可直接根据炭疽菌转化子致病能力情况来直接筛选出橡胶白粉菌的无毒基因，操作方法简便有效，本专利技术使用替代的方法，成功利用转化炭疽菌，直接有效筛选和鉴定橡胶树白粉菌的无毒基因。
[0021](2)本专利技术通过选用了胶孢炭疽菌核糖体蛋白的组成型启动子CgRP60，保证了白粉菌的潜在分泌蛋白基因在橡胶树炭疽菌中的较高活性，提高异源基因在炭疽菌内稳定表达。
[0022](3)本专利技术在橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体中，通过构建遗传霉素G418抗性筛选炭疽菌转化子，同时通过3
×
HA标签前度检测，有效确定炭疽菌转化子中白粉菌效应蛋白基因表达效果。
[0023](3)本专利技术的橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，可直接通过不同效应蛋白基因转化子的致病力筛选出白粉菌无毒基因，实现橡胶树白粉菌无毒基因的更加快速地筛选和鉴定，有利于加深对白粉菌和寄主互作的认识，有利于加强橡胶白粉病的防控以及抗病品种选育。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例携带白粉菌候选无毒基因的pFL2质粒的结构示意图；
[0025]图2为本专利技术实施例接种野生型炭疽菌和被转化的橡胶树白粉菌无毒基因的炭疽菌的橡胶树叶片的侵染发病效果的对比图；其中，A为接种野生型炭疽菌的橡胶树叶片，B为接种含无毒基因的炭疽菌的橡胶树叶片，括号标记病斑边缘，箭头指示未发病叶片的接种点。
具体实施方式
[0026]为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。
[0027]本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]本专利技术课题组前期在橡胶树白粉菌基因组中鉴定了133个潜在分泌蛋白(candidate secreted effector proteins)编码基因，本专利技术技术方案提供的橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，有利于快速筛选和挖掘潜在的橡胶树白粉菌无毒基因。
[0030]实施例1
‑
橡胶树白粉菌效应蛋白的表达载体的构建
[0031]本专利技术以一个潜在效应蛋白SP04187的编码基因为例。将白粉菌效应蛋白SP04187编码基因cDNA序列克隆至含有T7启动子和遗传霉素G418抗性基因的pFL2真菌表达载体中，将该白粉菌效应蛋白编码基因插入在3
×
HA标签之前，在胶孢炭疽菌核糖体蛋白的组成型启动子CgRP60之后，得到橡胶树白粉菌效应蛋白的表达载体；
[0032]其中，CgRP60启动子的核苷酸序列为GATTCAGCGAGCGCAGTGCCCCCAAAGACTTGGAGAGACGCGAGCCTGGACGTCGGGCGAAATCGTGGGAGTCGCGGGCGAAAAAATCGCAAAAAATGAGGAGATGGTCGCGGAGGACACGCAAC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：由橡胶树白粉菌基因中选取潜在效应蛋白的编码基因A；步骤2：构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体，并通过在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A，得到炭疽菌转化子；步骤3：根据测定的效应蛋白设计PCR引物，以及利用定量PCR检测效应蛋白在菌株中的表达量，得到效应蛋白表达程度高的炭疽菌转化子，培养，收集分生孢子，并接种至离体的橡胶叶片上，测定炭疽菌转化子的致病能力；步骤4：以野生型胶孢炭疽菌作为对照；若相比野生型，胶孢炭疽菌转化子的致病力下降，则表明转化的白粉菌效应蛋白触发了橡胶树的抗病性，该效应蛋白编码基因A为无毒基因。2.如权利要求1所述的一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，其特征在于：步骤2中，所述构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体的方法为，将白粉菌效应蛋白编码基因cDNA序列克隆至含有T7启动子和遗传霉素G418抗性基因的pFL2真菌表达载体中，将该白粉菌效应蛋白编码基因插入在3
×
HA标签之前，在胶孢炭疽菌核糖体蛋白的组成型启动子CgRP60之后，得到橡胶树白粉菌效应蛋白的表达载体。3.如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李潇，刘梦瑶，殷金瑶，刘玉涵，林春花，缪卫国，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：