一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建和用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，且公开了一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，包括一下步骤：S1：序列合成和克隆；S2：重组蛋白HBcAg

【技术实现步骤摘要】
一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建和用途。

技术介绍

[0002]PEDV能感染各种年龄阶段的猪，但尤以哺乳仔猪发病最为严重，发病猪出现呕吐、腹泻和脱水等症状，死亡率高达80％以上，给全球养猪业造成了重大经济损失。疫苗接种是预防PEDV感染的重要手段，目前在国内猪场使用的减毒活疫苗和灭活疫苗均不能有效阻止病毒的感染和传播。因此，急需开发PEDV新型疫苗。
[0003]病毒样颗粒(VLPs)保留了病毒颗粒的天然构象，能高密度的展示抗原表位，有更强的免疫原性和安全性，已成为新型疫苗的研究方向之一。近年来，猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、兔出血症病毒和水貂肠炎病毒等VLPs疫苗均已成功上市。随着VLPs技术的深入发展，HBcAg、腺病毒和HIVgag蛋白载体的VLPs已成为其他病原疫苗研发平台。HBcAg具有高度的免疫原性，能自组装成一个均匀对称的二十面体，可在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞等多种宿主进行表达。HBcAg的N端、C端和免疫显性区(MIR)有很多既有高免疫原性又可进行氨基酸替换的位点，可供外源表位基因插入。HBcAg载体平台具有以下3大优势：
①
产量高，
②
免疫原性强，
③
多个插入位点，
④
可在多个表达系统中使用，
⑤
工艺简单、易纯化，
⑥
可诱导Th1/Th2细胞免疫应答。然而，目前尚无基于该载体的疫苗。近年来，HBcAg展示外源抗原平台在人用疫苗中取得了较大进展，比如脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、手足口病病毒、HIV
‑
1、汉坦病毒和流感病毒等表位在HBcAg上能有效表达。有研究者以HBcAg为载体，融合了肠道病毒VP1和VP2抗原表位，结果双表位疫苗诱导的抗体水平和中和效价高于单表位，为开发双价、多价疫苗提供了新的思路。兽用疫苗在HBcAg载体平台的研究尚处于起步阶段，研制的传染性法氏囊病毒、PEDV和猪繁殖与呼吸综合征病毒表位疫苗均具有较好的免疫原性。
[0004]本专利技术将PEDV S蛋白的B细胞表位插入HBcAg中，大肠杆菌表达量达到1.0mg/mL以上，透射电镜观察到VLPs形成，制备的疫苗能诱导小鼠产生较高的中和抗体水平，具有成为新型候选疫苗的潜力，研制PEDV多抗原表位嵌合病毒样颗粒疫苗，可为大肠杆菌源高效亚单位疫苗研发提供新的策略。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建和用途，基于B细胞表位可诱导机体产生较强的中和抗体，运用HBcAg为载体，嵌合PEDV B细胞表位，用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，透射电镜检测到病毒样颗粒结构。制备的疫苗能诱导小鼠产生较高水平的荧光抗体和中和抗体。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述所述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，包括以下步骤：
[0009]S1：序列合成和克隆
[0010]该基因序列合成于金斯瑞生物科技有限公司，该表位氨基酸序列为748YSNIGVCK755，经双酶切证明合成序列正确后连接在pET
‑
28a(+)载体上，构建成质粒pET
‑
28a(+)
‑
HBcAg
‑
PEDV S1。
[0011]S2：重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1的原核表达
[0012]将测序鉴定正确后的重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
HBcAg
‑
PEDV S1，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落至含有卡那霉素(浓度为50g/mL)的LB培养基中，37℃、220r/min摇床振荡培养至OD值为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG(1mmol/L)，37℃诱导5h收样，进行SDS
‑
PAGE电泳检测，随后扩大诱导的菌液量。目的蛋白得到了高效表达，大小为29kD，与预期相符。
[0013]S3：重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1的纯化
[0014]利用镍柱纯化重组蛋白，先分别用5倍柱体积的ddH2O和20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，此步重复一次；接着利用10倍柱体积的20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；最后利用200mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、200mM咪唑)洗脱目的蛋白，以1mL/min流速洗脱柱子，每1mL洗脱目的蛋白的洗脱液储存在一个EP管内，SDS
‑
PAGE电泳检测蛋白的纯化效果。
[0015]S4：SDS PAGE鉴定重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1
[0016]将纯化后的HBcAg
‑
PEDV S1蛋白进行SDS
‑
PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，目的蛋白可有效纯化。
[0017]优选的，所述B细胞表位嵌合在HBcAg中，核苷酸序列为SEQ ID NO.1：
[0018]Tatagtaacataggtgtttgtaaacatcatcaccatcaccatatggacattgacccttacaaagaatttggagctactgtggagcttctcagctttttgccttctgacttctttccttctgtcaggtgtctccttgacactgcctcagctctttatagggaagccttggagtctcctgagcattgctcacctcaccatactgcactcaggcaagccattctctgctggggagaattgatgactcttgctacctgggtgggtaacaatctagaggatccatatagtaacataggtgtttgtaaagcatccagagatcttgttgttaactatgttaatactaatgtgggtttgaagatcaggcaactcttgtggtttcatatatcttgccttacttttggaagagagactgtacttgaatatttggtctcttttggagtgtggatttgtactcctccagcctatagaccaccaaatgcccctatcttgtcgactcttccagaaactactgttgtt。
[0019]一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建的用途，包括以下步骤：
[0020]S1:透射电镜检测HBcAg
‑
PEDV S1 VLP形态本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，其特征在于，包括一下步骤：S1：序列合成和克隆；S2：重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1的原核表达；S3：重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1的纯化；S4：SDS PAGE鉴定重组蛋白HBcAg
‑
PEDV S1。2.根据权利要求1所述的一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，其特征在于：所述S1：该表位氨基酸序列为748YSNIGVCK755，经双酶切证明合成序列正确后连接在pET
‑
28a(+)载体上，构建成质粒pET
‑
28a(+)
‑
HBcAg
‑
PEDV S1。3.根据权利要求1所述的一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，其特征在于：所述S2：将测序鉴定正确后的重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
HBcAg
‑
PEDV S1，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落至含有卡那霉素(浓度为50g/mL)的LB培养基中，37℃、220r/min摇床振荡培养至OD值为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG(1mmol/L)，37℃诱导5h收样，进行SDS
‑
PAGE电泳检测，随后扩大诱导的菌液量。目的蛋白得到了高效表达，大小为29kD，与预期相符。4.根据权利要求1所述的一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，其特征在于：所述S3：利用镍柱纯化重组蛋白，先分别用5倍柱体积的ddH2O和20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，此步重复一次，接着利用10倍柱体积的20mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白，最后利用200mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、200mM咪唑)洗脱目的蛋白，以1mL/min流速洗脱柱子，每1mL洗脱目的蛋白的洗脱液储存在一个EP管内，SDS
‑
PAGE电泳检测蛋白的纯化效果。5.根据权利要求1所述的一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B细胞表位构建，其特征在于：所述S4：将纯化后的HBcAg
‑
PEDV S1蛋白进行SDS
‑
PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，目的蛋白可有效纯化。6.根据权利要求1所述的一种诱导猪流行性腹泻病毒中和抗体的嵌合B...

【专利技术属性】
技术研发人员：李基棕，李彬，李荣海，周金柱，赵淑庆，张宝太，钟纯燕，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：