用于同时消耗木糖和葡萄糖以从第二代糖产生化学物质的代谢工程制造技术

本公开提供了用于对微生物进行遗传修饰以产生能够同时消耗木糖和葡萄糖以增加所期望的化学产物的生产率输出的微生物的方法。本公开还提供了能够同时消耗木糖和葡萄糖的经修饰的细菌，以及包含所述微生物的组合物。以及包含所述微生物的组合物。以及包含所述微生物的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于同时消耗木糖和葡萄糖以从第二代糖产生化学物质的代谢工程
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年4月4日提交的美国临时申请号62/829,398的优先权，该临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以文本形式提供，代替纸质副本，并且据此以引用的方式并入说明书中。含序列表的文本文件名称为BRSK_021_01WO_ST25.txt。文本文件为222kb，创建于2020年4月4日，并且以电子形式提交。

技术介绍

[0005]从替代原料(如戊糖)产生所期望的化学物质(诸如单乙二醇、乙醇酸、C3化合物(诸如丙酮、异丙醇和丙烯)、氨基酸和多元醇)是从石油基化学物质获得所述化学物质的替代方案。
[0006]木糖(戊糖)的利用是区别于大多数可再生化学物质方案的来源。考虑到利用木质纤维素生物质作为原料不要求利用会以其他方式产生食物的植物，木质纤维素生物质是一种有前景的可再生原料。由于木质纤维素生物质的可持续性和全球可用性，它作为可再生原料更有前景。木质纤维素糖的分离和离析是一种在不增加土地利用的情况下增加糖产量的选择。木糖是半纤维素水解产物中的主要碳源，其次是葡萄糖和阿拉伯糖。木糖通常占半纤维素水解产物中存在的糖的70
‑
80％，而葡萄糖则占10
‑
20％。
[0007]在大肠杆菌(Escherichia coli)中，即使最少量的葡萄糖也会完全抑制木糖的摄取(即使木糖是主要糖)，从而限制糖至所期望的化学物质的总体转化。在工业过程中，生产率(克产物/升每小时)是确保经济可行性的关键因素，因此微生物菌株必须能够不断以最大速率将主要底物(诸如木糖)转化为产物。考虑到葡萄糖存在于木质纤维素水解产物中，在分批操作中，木糖摄取将被延迟直到葡萄糖完全耗尽，从而降低生产率。如果我们考虑补料分批或连续操作，则含有木糖和葡萄糖的流被不断送入反应器中，增强了葡萄糖的阻遏潜力，因此无法最大限度地提高能够从常见可再生原料产生一种或多种产物的微生物的潜在生产率。
[0008]需要最大限度地提高能够从可再生原料产生所期望的产物的微生物的生产率，特别是需要最大限度地利用多种碳源，同时最大限度地减少或消除碳源对微生物的阻遏活性。
[0009]如本文所述，本公开提供了用于对微生物进行工程化改造以利用混合糖流来产生所期望的化学物质的方法和组合物，而无需考虑由于混合糖流的存在而引起的典型分解代谢阻遏效应。

技术实现思路

[0010]在一些方面，本公开一般涉及能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生发酵产物的重
组微生物，其中所述重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，并且其中所述微生物包含以下一项或多项：(a)所述微生物的基因组中的戊糖ATP结合转运蛋白的缺失或失活，以使得所述转运蛋白不表达；(b)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其编码至少一个C5糖同向转运蛋白(symporter)并且可操作地连接至一个或多个组成型启动子；其中所述C5糖同向转运蛋白包括：(1)木糖同向转运蛋白和/或(2)阿拉伯糖同向转运蛋白；(c)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其(1)编码木糖异构酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活，和/或(2)编码木糖脱氢酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木糖异构酶和/或一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。
[0011]在一些方面，所述微生物产生的所述发酵产物是一种或多种包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳的分子。在一些方面，同时产生两种或更多种分子。
[0012]在一些方面，本公开一般涉及能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生发酵产物的重组大肠杆菌，其中所述重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，并且其中所述微生物包含以下一项或多项：(a)所述微生物的基因组中的ATP结合转运蛋白araFGH和xylFGH的缺失或失活，以使得所述转运蛋白不表达；(b)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其编码至少一个C5糖同向转运蛋白并且可操作地连接至一个或多个组成型启动子；其中所述C5糖同向转运蛋白包括：(1)木糖同向转运蛋白和/或(2)阿拉伯糖同向转运蛋白；(c)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其(1)编码木糖异构酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活，和/或(2)编码木糖脱氢酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木糖异构酶和/或一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。
[0013]在一些方面，本公开一般涉及能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生单乙二醇(MEG)和/或丙酮的重组微生物，其中所述重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，并且包含以下一项或多项：(a)亲本微生物的基因组中的aldA、araFGH和xylFGH的缺失或失活；以及(b)至少一个内源性或外源性核酸分子的表达，所述核酸分子可操作地连接至一个或多个组成型启动子且编码C5糖同向转运蛋白；其中所述重组微生物表达MEG和/或丙酮产生途径。
[0014]在一些方面，如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物还包含glcDEF的缺失或失活。在一些方面，所述C5同向转运蛋白由所述araFGH基因座处的GAPDH启动子控制。在一些方面，所述C5糖同向转运蛋白是木糖同向转运蛋白XylE。在一些方面，所述XylE包括包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些方面，所述XylE由包含SEQ ID NO:48的核酸序列编码。在一些方面，所述木糖同向转运蛋白是所述微生物内源性的。
[0015]在一些方面，所述C5糖同向转运蛋白是阿拉伯糖同向转运蛋白AraE。在一些方面，所述AraE包括包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些方面，所述AraE由包含SEQ ID NO:46的核酸序列编码。在一些方面，所述阿拉伯糖同向转运蛋白是所述微生物内源性的。
[0016]在一些方面，所述木糖的摄取对其他单糖的分解代谢阻遏不敏感。在一些方面，所述微生物包含功能性磷酸转移酶系统。在一些方面，所述微生物包含编码cAMP受体蛋白(CRP)的天然野生型核酸序列。在一些方面，所述CRP包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些方面，所述CRP由包含SEQ ID NO:9的核酸序列编码。
[0017]在一些方面，所述木糖同向转运蛋白的组成型过表达使得能够将木糖从所述原料
连续输入到所述微生物中。在一些方面，所述阿拉伯糖同向转运蛋白的组成型过表达使得能够将木糖从所述原料连续输入到所述微生物中。在一些方面，连续木糖输入独立于其他糖在所述原料中的存在而发生。
[0018]在一些方面，所述重组微生物包括MEG产生途径，所述途径具有以下(c)至(e)中的一项或多项；(c)一个或多个编码木糖异构酶和/或酮己糖激酶和/或果糖二磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸序列的表达，所述核酸序列可操作地连接至一个或多个组成型启动子；(d)至少一个编码羟乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生发酵产物的重组微生物，其中所述重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，并且其中所述微生物包含以下一项或多项：(a)所述微生物的基因组中的戊糖ATP结合转运蛋白的缺失或失活，以使得所述转运蛋白不表达；(b)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其编码至少一种C5糖同向转运蛋白且可操作地连接至一个或多个组成型启动子；其中所述C5糖同向转运蛋白包括：(1)木糖同向转运蛋白和/或(2)阿拉伯糖同向转运蛋白；(c)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其(1)编码木糖异构酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活和/或(2)编码木糖脱氢酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木糖异构酶和/或一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。2.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物产生的所述发酵产物是一种或多种包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳的分子。3.如权利要求2所述的重组微生物，其中同时产生两种或更多种分子。4.一种能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生发酵产物的重组大肠杆菌，其中重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，并且其中所述微生物包含以下一项或多项：(a)所述微生物的基因组中的ATP结合转运蛋白araFGH和xylFGH的缺失或失活，以使得所述转运蛋白不表达；(b)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其编码至少一种C5糖同向转运蛋白且可操作地连接至一个或多个组成型启动子；其中所述C5糖同向转运蛋白包括：(1)木糖同向转运蛋白和/或(2)阿拉伯糖同向转运蛋白；(c)一个或多个内源性或外源性核酸序列，其(1)编码木糖异构酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活和/或(2)编码木糖脱氢酶且可操作地连接至一个或多个组成型启动子，以及一种或多种木糖异构酶和/或一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。5.一种能够从包含木糖和葡萄糖的原料产生单乙二醇(MEG)和/或丙酮的重组微生物，其中所述重组微生物同时利用木糖和葡萄糖，包含以下一项或多项：(a)亲本微生物的基因组中的aldA、araFGH和xylFGH的缺失或失活；以及(b)至少一个内源性或外源性核酸分子的表达，所述核酸分子可操作地连接至一个或多个组成型启动子且编码C5糖同向转运蛋白；其中所述重组微生物表达MEG和/或丙酮产生途径。6.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物还包含glcDEF的缺失或失活。7.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述C5同向转运蛋白由araFGH基因座处的GAPDH启动子控制。8.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述C5糖同向转运蛋白是木糖同向转运蛋白XylE。9.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述XylE包括包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。10.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述XylE由包含SEQ ID NO:48的核酸序列编
码。11.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述木糖同向转运蛋白是所述微生物内源性的。12.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述C5糖同向转运蛋白是阿拉伯糖同向转运蛋白AraE。13.如权利要求12所述的重组微生物，其中所述AraE包括包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。14.如权利要求12所述的重组微生物，其中所述AraE由包含SEQ ID NO:46的核酸序列编码。15.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述阿拉伯糖同向转运蛋白是所述微生物内源性的。16.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述木糖的摄取对其他单糖的分解代谢阻遏不敏感。17.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物包含功能性磷酸转移酶系统。18.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物包含编码cAMP受体蛋白(CRP)的天然野生型核酸序列。19.如权利要求18所述的重组微生物，其中所述CRP包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。20.如权利要求18所述的重组微生物，其中所述CRP由包含SEQ ID NO:9的核酸序列编码。21.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述木糖同向转运蛋白的组成型过表达使得能够将木糖从所述原料连续输入到所述微生物中。22.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述阿拉伯糖同向转运蛋白的组成型过表达使得能够将木糖从所述原料连续输入到所述微生物中。23.如权利要求5所述的重组微生物，其中连续木糖输入独立于其他糖在所述原料中的存在而发生。24.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述重组微生物包括MEG产生途径，所述途径具有以下(c)至(e)中的一项或多项；(c)一个或多个编码木糖异构酶和/或酮己糖激酶和/或果糖二磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸序列的表达，所述核酸序列可操作地连接至一个或多个组成型启动子；(d)至少一个编码羟乙醛还原酶的内源性或外源性核酸分子的表达，所述羟乙醛还原酶催化羟乙醛至MEG的转化；以及(e)亲本微生物的基因组中的一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。25.如权利要求24所述的重组微生物，其中(c)和(d)在由proD启动子控制的操纵子中。26.如权利要求25所述的重组微生物，其中所述proD启动子由包含SEQ ID NO:53的核酸序列编码。27.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述木糖异构酶是XylA。28.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述木糖异构酶是所述微生物内源性的。
29.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述XylA包括包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。30.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述XylA由包含SEQ ID NO:5的核酸序列编码。31.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述酮己糖激酶来自智人。32.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述酮己糖激酶是所述微生物异源性的。33.如权利要求32所述的重组微生物，其中所述酮己糖激酶是khk
‑
C。34.如权利要求33所述的重组微生物，其中所述khk
‑
C包括包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。35.如权利要求33所述的重组微生物，其中所述khk
‑
C由包含SEQ ID NO:11的核酸序列编码。36.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述果糖二磷酸醛缩酶来自智人。37.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述果糖二磷酸醛缩酶是所述微生物异源性的。38.如权利要求37所述的重组微生物，其中所述果糖二磷酸醛缩酶是aldoB。39.如权利要求38所述的重组微生物，其中所述aldoB包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。40.如权利要求38所述的重组微生物，其中所述aldoB由包含SEQ ID NO:50的核酸序列编码。41.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述羟乙醛还原酶是所述微生物内源性的。42.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述羟乙醛还原酶是fucO。43.如权利要求42所述的重组微生物，其中所述fucO包括包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。44.如权利要求42所述的重组微生物，其中所述fucO由包含SEQ ID NO:52的核酸序列编码。45.如权利要求24所述的重组微生物，其中所述木酮糖激酶是XylB。46.如权利要求45所述的重组微生物，其中所述xylB包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。47.如权利要求45所述的重组微生物，其中所述xylB由包含SEQ ID NO:13的核酸序列编码。48.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述重组微生物包括MEG产生途径，所述途径具有以下(c)至(e)中的一项或多项；(c)一个或多个编码木糖脱氢酶和/或木糖酸内酯酶和/或木糖脱水酶的内源性或外源性核酸序列的表达，所述核酸序列可操作地连接至一个或多个组成型启动子；(d)至少一个编码羟乙醛还原酶的内源性或外源性核酸分子的表达，所述羟乙醛还原酶催化羟乙醛至MEG的转化；以及(e)亲本微生物的基因组中的一种或多种木糖异构酶和/或一种或多种木酮糖激酶的缺失或失活。49.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖脱氢酶来自新月柄杆菌
(Caulobacter crescentus)、异种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia xenovorans)、沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)。50.如权利要求49所述的重组微生物，其中所述木糖脱氢酶是xdh。51.如权利要求50所述的重组微生物，其中所述xdh包括包含SEQ ID NO:16、17或19的氨基酸序列。52.如权利要求50所述的重组微生物，其中所述xdh由包含SEQ ID NO:15、18或97的核酸序列编码。53.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖脱氢酶是所述微生物异源性的。54.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖酸内酯酶来自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、异种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia xenovorans)、沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)。55.如权利要求54所述的重组微生物，其中所述木糖酸内酯酶是xylC。56.如权利要求55所述的重组微生物，其中所述xylC包括包含SEQ ID NO:55、57或59的氨基酸序列。57.如权利要求55所述的重组微生物，其中所述xylC由包含SEQ ID NO:54、56或58的核酸序列编码。58.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖酸内酯酶是所述微生物异源性的。59.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖酸内酯酶是所述微生物内源性的。60.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖脱水酶来自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、异种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia xenovorans)、沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)。61.如权利要求60所述的重组微生物，其中所述木糖脱水酶是xylD。62.如权利要求61所述的重组微生物，其中所述xylD包括包含SEQ ID NO:61、63或65的氨基酸序列。63.如权利要求61所述的重组微生物，其中所述xylD由包含SEQ ID NO:60、62或64的核酸序列编码。64.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖脱水酶是所述微生物异源性的。65.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖脱水酶是所述微生物内源性的。66.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述羟乙醛还原酶是所述微生物内源性的。67.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述羟乙醛还原酶是fucO。68.如权利要求49所述的重组微生物，其中所述fucO包括包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。69.如权利要求49所述的重组微生物，其中所述fucO由包含SEQ ID NO:52的核酸序列编码。70.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述羟乙醛还原酶是所述微生物异源性的。71.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木糖异构酶是XylA。72.如权利要求71所述的重组微生物，其中所述xylA包括包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。73.如权利要求71所述的重组微生物，其中所述xylA由包含SEQ ID NO:5的核酸序列编
码。74.如权利要求48所述的重组微生物，其中所述木酮糖激酶是XylB。75.如权利要求74所述的重组微生物，其中所述xylB包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。76.如权利要求74所述的重组微生物，其中所述xylB由包含SEQ ID NO:13的核酸序列编码。77.如权利要求24或48所述的重组微生物，其中所述重组微生物还包含丙酮产生途径，所述途径具有以下(f)至(h)中的一项或多项；(f)至少一个编码乙酰乙酰基辅酶A硫解酶的外源性核酸分子的表达；(g)至少一个编码乙酸:乙酰乙酰基辅酶A转移酶的外源性核酸分子的表达；以及(h)至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子的表达，所述乙酰乙酸脱羧酶催化乙酰乙酸至丙酮的转化。76.如权利要求77所述的重组微生物，其中(f)、(g)和(h)在由OXB11启动子控制的操纵子中。77.如权利要求76所述的重组微生物，其中所述OXB11启动子由包含SEQ ID NO:78的核酸序列编码。78.如权利要求77所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰基辅酶A硫解酶来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。79.如权利要求78所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰基辅酶A硫解酶包括包含SEQ ID NO:67或69的氨基酸序列。80.如权利要求78所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰基辅酶A硫解酶由包含SEQ ID NO:66或68的核酸序列编码。81.如权利要求77所述的重组微生物，其中所述乙酸:乙酰乙酰基辅酶A转移酶是AtoDA。82.如权利要求81所述的重组微生物，其中AtoDA亚基α包括包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。83.如权利要求81所述的重组微生物，其中AtoDA亚基α由包含SEQ ID NO:70的核酸序列编码。84.如权利要求83所述的重组微生物，其中AtoDA亚基β包括包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。85.如权利要求83所述的重组微生物，其中所述AtoDA亚基β由包含SEQ ID NO:71的核酸序列编码。86.如权利要求77所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酸脱羧酶来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。87.如权利要求86所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酸脱羧酶是Adc。88.如权利要求86所述的重组微生物，其中所述Adc包括包含SEQ ID NO:75或77的氨基酸序列。89.如权利要求88所述的重组微生物，其中所述Adc由包含SEQ ID NO:74或76的核酸序列编码。
90.如权利要求24或48所述的重组微生物，其中所述重组微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：布拉斯科公司，
类型：发明
国别省市：