一种重金属吸附与逃逸控制工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了重金属吸附及逃逸控制的工程菌株及其构建方法与应用。所述工程菌株是将成套系统导入宿主菌后得到的菌；所述成套系统包括重金属离子调控蛋白、冰核蛋白表面展示的重金属离子吸附蛋白、冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白和逃逸控制元件；所述逃逸控制元件包括阻遏蛋白PhlF、TetR、LacI与致死蛋白。本发明专利技术基于合成生物学技术，提供了在大肠杆菌或恶臭假单胞菌中实现重金属吸附、吸附后微生物富集及逃逸控制等功能于一体的水体重金属吸附及逃逸控制微生物，利用标准化的生物元件实现了复杂、精细和可预测遗传回路的搭建，经过优化设计后能够实现在不同浓度汞离子条件下完成吸附、富集和死亡行为的基因线路。富集和死亡行为的基因线路。

【技术实现步骤摘要】
一种重金属吸附与逃逸控制工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重金属吸附与逃逸控制工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]自然环境中的Hg、Cd、Pb等会对自然界生物体的生长造成不良影响，并且在食物链的富集作用下最终会威胁到人类健康。重金属成分未经严格处理的工业污染物的直接排放已经对某些水体环境造成了非常严重的污染，因此对水体环境中重金属的清理已经成为亟待解决的重大环境问题。
[0003]自然环境中的一些微生物参与了重金属的生物化学循环，并成为其重要的组成部分。这些天然的微生物是维持环境汞含量平衡的重要环节。利用这些微生物对重金属吸附、沉淀、还原能力理论上能够对环境重金属污染进行治理和修复。
[0004]目前，基于微生物的重金属修复包括利用细胞表面展示吸附重金属、生物催化还原重金属离子至低毒的价态、以及分泌聚集蛋白或硫化氢等化学物质用来聚集沉淀环境中的重金属离子。但上述基于微生物的重金属吸附都存在吸附效率不高，需要进一步的改造以提高活力；另一方面，上述所有被吸附的重金属仍存在于环境中，存在二次污染的风险，亟待开发一种快速、成本低的回收手段；最后，生物安全问题日渐已经成为国际社会热点关注的问题，针对转基因微生物开发防逃逸技术，实现其环境可控也是大势所趋，现有的逃逸控制技术往往还停留在学术文献的理论层面，鲜有应用研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种重金属吸附与逃逸控制工程菌株及其构建方法与应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种成套系统。
[0007]本专利技术提供的成套系统包括重金属离子响应元件、重金属离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；所述重金属离子响应元件包括重金属离子调控蛋白；所述重金属离子吸附元件包括冰核蛋白表面展示的重金属离子吸附蛋白；所述菌体富集元件包括冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白；所述逃逸控制元件包括阻遏蛋白PhlF、阻遏蛋白TetR、阻遏蛋白LacI和致死蛋白。
[0008]上述成套系统中，所述重金属离子不仅包括现有技术中常见的重金属离子，如As
3+
、Hg
2+
、Cd
2+
、Cu
2+
、Pb
2+
、Zn
2+
等，还包括除重金属离子之外其它可被生物传感器检查的各种有机污染物，如苯酚、有机磷化合物等。进一步的，所述重金属离子为Hg
2+
。
[0009]在本专利技术的一个具体实施例中，所述成套系统包括汞离子响应元件、汞离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；
[0010]所述汞离子响应元件包括启动子1、核糖体结合位点1、由所述启动子1启动表达的汞离子调控蛋白MerR基因；
[0011]所述汞离子吸附元件包括启动子2、核糖体结合位点2、由所述启动子2启动表达的
冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因；
[0012]所述菌体富集元件包括启动子2、核糖体结合位点3、由所述启动子2启动表达的冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因；
[0013]所述逃逸控制元件包括启动子2、核糖体结合位点4、由所述启动子2启动表达的阻遏蛋白PhlF基因，启动子4及由所述启动子4启动表达的阻遏蛋白TetR基因，启动子6及由所述启动子6启动表达的阻遏蛋白LacI基因，启动子7及由所述启动子7启动表达的致死蛋白CcdB基因；
[0014]所述启动子1的核苷酸序列如下：CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC；所述启动子2的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTACGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAA；所述启动子4的核苷酸序列如下：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG；所述启动子6的核苷酸序列如下：GCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCC；所述启动子7的核苷酸序列如下：TCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACATGACCTTAACGATACGGTACGTTTCGTATCATGACCTTAACGATACGGTACGTTTCGTATCATA；所述核糖体结合位点1的核苷酸序列如下：TACTAGAGTCACACAGGAAAGTACTAG；所述核糖体结合位点2的核苷酸序列如下：TACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG；所述核糖体结合位点3的核苷酸序列如下：TACTAGAGAAAGAGGAGAAAGGTACC；所述核糖体结合位点4的核苷酸序列如下：TACTAGAAAGAATAGTAATACTAG；所述汞离子调控蛋白MerR基因的核苷酸序列如序列15第2264-2698位所示；所述冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因的核苷酸序列如序列17第653-1213位所示；所述冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因的核苷酸序列如序列17第1240-2550位所示；所述阻遏蛋白LacI基因的核苷酸序列如序列9第7-1089位所示；所述阻遏蛋白PhlF基因的核苷酸序列如序列17第24-626位所示；所述阻遏蛋白TetR基因的核苷酸序列如序列9第1371-1994位所示(Tn10来源)；所述致死蛋白CcdB基因的核苷酸序列如序列6第63-368位所示。
[0015]在本专利技术的另一个具体实施例中，所述成套系统包括汞离子响应元件、汞离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；
[0016]所述汞离子响应元件包括启动子1、核糖体结合位点1、由所述启动子1启动表达的汞离子调控蛋白MerR基因；
[0017]所述汞离子吸附元件包括启动子3、核糖体结合位点2、由所述启动子3启动表达的冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因；
[0018]所述菌体富集元件包括启动子3、核糖体结合位点3、由所述启动子3启动表达的冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因；
[0019]所述逃逸控制元件包括启动子5、核糖体结合位点4、由所述启动子5启动表达的阻遏蛋白PhlF基因，启动子4及由所述启动子4启动表达的阻遏蛋白TetR基因，启动子6及由所述启动子6启动表达的阻遏蛋白LacI基因，启动子7及由所述启动子7启动表达的致死蛋白EcoRI基因；
[0020]所述启动子1的核苷酸序列如下：TTTACGGCTAGCTCAGCCCTAGGTATTATGCTAGC；所述启动子3的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTACGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAA；所述启动子4的核苷酸序列如下：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG；所述启动子5的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.成套系统，其包括重金属离子响应元件、重金属离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；所述重金属离子响应元件包括重金属离子调控蛋白；所述重金属离子吸附元件包括冰核蛋白表面展示的重金属离子吸附蛋白；所述菌体富集元件包括冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白；所述逃逸控制元件包括阻遏蛋白PhlF、阻遏蛋白TetR、阻遏蛋白LacI和致死蛋白。2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述重金属离子为汞离子。3.根据权利要求2所述的成套系统，其特征在于：所述成套系统包括汞离子响应元件、所述汞离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；所述汞离子响应元件包括启动子1、核糖体结合位点1、由所述启动子1启动表达的汞离子调控蛋白MerR基因；所述汞离子吸附元件包括启动子2、核糖体结合位点2、由所述启动子2启动表达的冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因；所述菌体富集元件包括启动子2、核糖体结合位点3、由所述启动子2启动表达的冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因；所述逃逸控制元件包括启动子2、核糖体结合位点4、由所述启动子2启动表达的阻遏蛋白PhlF基因，启动子4及由所述启动子4启动表达的阻遏蛋白TetR基因，启动子6及由所述启动子6启动表达的阻遏蛋白LacI基因，启动子7及由所述启动子7启动表达的致死蛋白CcdB基因；所述启动子1的核苷酸序列如下：CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC；所述启动子2的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTACGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAA；所述启动子4的核苷酸序列如下：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG；所述启动子6的核苷酸序列如下：GCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCC；所述启动子7的核苷酸序列如下：TCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACATGACCTTAACGATACGGTACGTTTCGTATCATGACCTTAACGATACGGTACGTTTCGTATCATA；所述核糖体结合位点1的核苷酸序列如下：TACTAGAGTCACACAGGAAAGTACTAG；所述核糖体结合位点2的核苷酸序列如下：TACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG；所述核糖体结合位点3的核苷酸序列如下：TACTAGAGAAAGAGGAGAAAGGTACC；所述核糖体结合位点4的核苷酸序列如下：TACTAGAAAGAATAGTAATACTAG；所述汞离子调控蛋白MerR基因的核苷酸序列如序列15第2264-2698位所示；所述冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因的核苷酸序列如序列17第653-1213位所示；所述冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因的核苷酸序列如序列17第1240-2550位所示；所述阻遏蛋白LacI基因的核苷酸序列如序列9第7-1089位所示；所述阻遏蛋白PhlF基因的核苷酸序列如序列17第24-626位所示；所述阻遏蛋白TetR基因的核苷酸序列如序列9第1371-1994位所示；所述致死蛋白CcdB基因的核苷酸序列如序列6第63-368位所示。
4.根据权利要求2所述的成套系统，其特征在于：所述成套系统包括汞离子响应元件、所述汞离子吸附元件、菌体富集元件和逃逸控制元件；所述汞离子响应元件包括启动子1、核糖体结合位点1、由所述启动子1启动表达的汞离子调控蛋白MerR基因；所述汞离子吸附元件包括启动子3、核糖体结合位点2、由所述启动子3启动表达的冰核蛋白表面展示的汞离子吸附蛋白INP-CL5基因；所述菌体富集元件包括启动子3、核糖体结合位点3、由所述启动子3启动表达的冰核蛋白表面展示的链霉亲和素结合蛋白INP-msA2基因；所述逃逸控制元件包括启动子5、核糖体结合位点4、由所述启动子5启动表达的阻遏蛋白PhlF基因，启动子4及由所述启动子4启动表达的阻遏蛋白TetR基因，启动子6及由所述启动子6启动表达的阻遏蛋白LacI基因，启动子7及由所述启动子7启动表达的致死蛋白EcoRI基因；所述启动子1的核苷酸序列如下：TTTACGGCTAGCTCAGCCCTAGGTATTATGCTAGC；所述启动子3的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTACGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAA；所述启动子4的核苷酸序列如下：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG；所述启动子5的核苷酸序列如下：CATATCGCTTGACTCCGTACATGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛宇斌，杜沛，于波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：