一种重组4,6-α-葡萄糖基转移酶GTFC及其在抗消化型低热量α-葡聚糖生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组4,6

【技术实现步骤摘要】
sporothermodurans。
[0009]本专利技术提供一种表达载体，所述载体以pHY系列载体为出发载体，所述载体携带SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或表达氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC。
[0010]在一种实施方式中，所述pHY系列载体为pHY300PLK。
[0011]本专利技术提供一种生产4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC的方法，是将所述重组菌接种至含有80～120ug/mL卡那霉素的LB中在35～39℃、200～220rpm，培养8～10h得到培养液，然后将培养液以培养基体积的5～10％的接种量接种到TB培养基中，先在35～39℃、200～220rpm，培养1.5～3h，当菌体达到一定浓度时，再进行摇瓶诱导发酵得到发酵液，发酵液经高压匀浆破碎后离心，上清即为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC。
[0012]在一种实施方式中，所述菌体OD
600
在0.5～1.0时进行摇瓶发酵。
[0013]在一种实施方式中，所述摇瓶发酵的条件为30～35℃、200～220rpm进行摇瓶诱导发酵45～50h。
[0014]本专利技术提供了一种制备抗消化型低热量α
‑
葡聚糖的方法，所述方法是以淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质为底物，应用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6
‑
α
>‑
葡萄糖基转移酶进行酶法转化。
[0015]在一种实施方式中，所述淀粉包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉；所述淀粉衍生物包括麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉；所述含有淀粉的物质包括大米蛋白肽。
[0016]在一种实施方式中，先将淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质在高温下糊化，制得糊化液，再将糊化液中添加普鲁兰酶，得到反应液，再向反应液中加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶进行反应，反应结束后得到含有α
‑
葡聚糖的反应液。
[0017]在一种实施方式中，将所述淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质配制成质量体积比为15％～25％的悬浊液，在60～80℃下糊化得到糊化液。
[0018]在一种实施方式中，向糊化液中添加10～80U/g底物的普鲁兰酶，在pH值5.0～7.5、35～40℃下反应20～24h。
[0019]在一种实施方式中，向利用普鲁兰酶处理过的反应液中添加2500～5000U/g底物的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶。
[0020]在一种实施方式中，将加入了4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶的反应液在pH值5.0～7.5、35～40℃下反应20～24h。
[0021]本专利技术提供了4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶在制备抗消化型低热量α
‑
葡聚糖和/或含有α
‑
1,6糖苷键的α
‑
葡聚糖中的应用，所述4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0022]本专利技术提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶的编码基因的表达载体、或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶的宿主细胞在制备含有抗消化型低热量α
‑
葡聚糖和/或含有α
‑
1,6糖苷键的α
‑
葡聚糖的产品中的应用。
[0023]在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体；所述宿主细胞包括但不限于枯草芽孢杆菌、
大肠杆菌、毕赤酵母或酿酒酵母。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术的方法以淀粉或含淀粉体系为底物，经高温糊化、同时添加普鲁兰酶脱支后，向反应液中添加Bacillus sporothermodurans 4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC进行反应合成一种富含79％α,1
‑
6糖苷键比例的α
‑
葡聚糖，这种α
‑
葡聚糖产物在体外消化模拟实验中表现出低葡萄糖量释放的抗消化能力，这种性质可以满足食品、保健品或化妆品等领域中对低能量抗水解能力的需求。
附图说明
[0026]图1为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC最适温度。
[0027]图2为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC最适pH。
[0028]图3为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC底物特异性，M表示标品，纵向的G1～G7分别表示标准样品的葡萄糖以及麦芽二糖到麦芽七糖；横向的G1～G7分别表示葡萄糖以及麦芽二糖到麦芽七糖，S表示蔗糖，G2'表示异麦芽二糖、G3'表示异麦芽三糖、N表示黑曲霉二糖、P表示潘糖，Pol表示多糖聚合物。
[0029]图4为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC产物特异性；表示核磁共振一维氢谱1HNMR。
[0030]图5为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfC产物特异性；表示高效凝胶过滤色谱HPGFC。
[0031]图6为4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶GtfCα
‑
葡聚糖产物体外消化模拟葡萄糖水解曲线。
具体实施方式
[0032]下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不局限于此。
[0033]实施例中所述的培养基配方如下：
[0034]LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
[0035]TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K2HPO4.3H2O 16.43，KH2PO
4 2.31。
[0036]RM培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，山梨醇90.0，甘露醇70.0。
[0037]实施例中所述的耐高温普鲁兰酶均购自山东隆科特酶制剂有限公司，酶活为2000U/mL。
[0038]胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备抗消化型低热量α
‑
葡聚糖的方法，其特征在于，以淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质为底物，应用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶进行酶法转化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉；所述淀粉衍生物包括麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉；所述含有淀粉的物质包括大米蛋白肽。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，先将淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质在高温下糊化，制得糊化液，再将糊化液中添加普鲁兰酶，得到反应液，再向反应液中加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6
‑
α
‑
葡萄糖基转移酶进行反应，反应结束后得到含有α
‑
葡聚糖的反应液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述淀粉、淀粉衍生物或含有淀粉的物质配制成质量体积比为15％～25％的悬浊液，在60～80℃下糊化得到糊化液。5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，向糊化液中添加10～80U/g底物的普鲁兰酶，在pH值5.0～7.5、35～40℃下反应20～24h。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，向利用普鲁兰酶处理过的反应液中添加2500～5000U/g底物的4,6
‑
α
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晟，吴敬，杨卫康，盛露菲，饶德明，黄燕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：