用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用，针对目前对于岩礁性鱼类eDNA的研究较少，本发明专利技术在不破坏生态环境的前提下通过采集黄鳍棘鲷生活水域的水样，运用分子技术进行检测，设计可以验证黄鳍棘鲷这一目标物种的荧光引物和Taqman探针，并最终确定了特异性强、敏感性高的COI基因的引物组合(特异性引物对和探针)，通过绝对定量，建立目标物种浓度与C

【技术实现步骤摘要】
用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用。

技术介绍

[0002]黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)隶属于鱼纲Pisces、鲈形目Perciformes、鲷科Sparidae、棘鲷属Acanthopagrus，广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸和中国台湾、福建、广东、广西沿海。
[0003]黄鳍棘鲷生活于近岸海域及河口湾，杂食性，其肉质鲜嫩、营养丰富，是一种重要的经济鱼类。作为一种岩礁性鱼类，黄鳍棘鲷没有远距离的洄游习性，但有明显的生殖迁移行为。黄鳍棘鲷养殖周期偏长，需一年半至两年才能达到5两左右的上市规格，极大限制了渔民的养殖该品种的热情。近年来，由于环境污染、过度捕捞等导致黄鳍棘鲷自然种群严重衰退，种质严重退化等。因此黃鳍棘鲷的资源保护具有重要的意义。而及时掌握黄鳍棘鲷种群的分布格局和种群大小，是黄鳍棘鲷资源保护和生物多样性研究的重要内容。
[0004]对于某些密度极小且具有特殊生活史的种群，检测其时空分布与调查其种群动态变化十分困难。环境DNA(Environment DNA,eDNA)技术是指从环境样品(比如土壤、沉积物和水体等)中直接提取目的基因片段后利用各种分子生物学技术进行定性或定量分析的方法。这一方法最早出现于上世纪80年代。之后20年间，随着样品采样、DNA提取、分析和测序等关键技术的突破，eDNA分析发展成为完整的物种分布检测技术手段。近年来，eDNA技术已被广泛应用于水生生物保护监测的研究中，包括许多濒危物种、入侵物种等特殊种群。荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)特异性高，能够对DNA进行量化分析，近年来逐渐替代普通PCR，成为eDNA分析的重要手段。
[0005]目前，针对岩礁性鱼类eDNA的研究较少，关于黄鳍棘鲷eDNA特异性扩增引物和荧光探针的相关研究还未见报道。因此，建立起黄鳍棘鲷eDNA的检测方法，实现黄鳍棘鲷的简单、快速、准确、客观的分子鉴定是目前开展黄鳍棘鲷资源保护的重要内容。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提出了用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合，可以用于鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷，并可确定水样中黄鳍棘鲷的浓度，对于通过环境DNA检测开展黄鳍棘鲷的资源保护具有非常重要的意义。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供了用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合，所述引物组合包括特异引物和探针，所述特异引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13所示。
[0009]本专利技术还提供了上述的引物组合在检测黄鳍棘鲷环境DNA中的应用。
[0010]本专利技术将黄鳍棘鲷的组织和水样样品通过PCR和琼脂糖凝胶电泳，验证每对引物
的特异性和敏感性，并根据特异性引物设计探针，通过qPCR验证探针的敏感性，最终得出一对可以检测水样中黄鳍棘鲷的特异性引物和探针。
[0011]本专利技术还提供了一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异引物。
[0012]本专利技术还提供了一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的荧光定量试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。
[0013]本专利技术还提供了一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，具体为：用上述的特异引物对黄鳍棘鲷生活环境的DNA进行PCR检测，通过检测条带的有无确定鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷。
[0014]优选地，PCR检测采用50μL体系，包括2
×
Taq Mix(1x)25μL，DNA模板(<500ng)1
‑
5μL，Primer F(0.1
‑
1.0uM)1μL，Primer R(0.1
‑
1.0uM)1μL，加无菌水至50μL。
[0015]优选地，PCR检测的反应程序采用3步法，具体设置如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；(3)72℃再延伸5min。
[0016]本专利技术还提供了一种适合黄鳍棘鲷eDNA的PCR荧光定量方法，具体为：用上述的引物组合对黄鳍棘鲷生活环境的DNA进行荧光定量PCR，并绘制黄鳍棘鲷COⅠ基因质粒标准品浓度与Ct值之间的标准曲线，最后根据标准曲线确定黄鳍棘鲷环境DNA的浓度。
[0017]优选地，荧光定量PCR的反应体系采用20μL体系，包括2
×
qPCR Mix 10μL，正向引物(10μmol/L)0.4μL，反向引物(10μmol/L)0.4μL，探针(10μmol/L)0.4μL，模板DNA2μL，PCR水6.8μL。
[0018]优选地，荧光定量PCR的扩增反应程序采用两步法，具体设置如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]针对目前对于岩礁性鱼类eDNA的研究较少，本专利技术在不破坏生态环境的前提下通过采集黄鳍棘鲷生活水域的水样，运用分子技术进行检测，设计可以验证黄鳍棘鲷这一目标物种的荧光引物和Taqman探针，并最终确定了特异性强、敏感性高的COI基因的引物组合(特异性引物对和探针)，通过绝对定量，建立目标物种浓度与C
t
值之间的关系，得到两者的标准曲线，本专利技术的引物组合可以用于鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷，并可确定水样中黄鳍棘鲷的浓度，对于通过环境DNA检测开展黄鳍棘鲷的资源保护具有非常重要的意义。
附图说明
[0021]图1为PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果(前五个是肌肉组织的DNA，后五个是水样eDNA)；
[0022]图2为55℃退火温度下黄鳍棘鲷肠DNA的PCR以及电泳结果；
[0023]图3为58℃退火温度下黄鳍棘鲷肠DNA的PCR以及电泳结果；
[0024]图4为55℃退火温度下水样DNA的PCR以及电泳结果；
[0025]图5为58℃退火温度下水样DNA的PCR以及电泳结果；
[0026]图6为黄鳍棘鲷mtDNA COⅠ基因的qPCR标准曲线。
具体实施方式
[0027]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
[0029]实施例1黄鳍棘鲷环境DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异引物和探针，所述特异引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13所示。2.权利要求1所述的引物组合在检测黄鳍棘鲷环境DNA中的应用。3.一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异引物。4.一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的荧光定量试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。5.一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，其特征在于，用权利要求1所述的特异引物对黄鳍棘鲷生活环境的DNA进行PCR检测，通过检测条带的有无确定鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷。6.根据权利要求5所述的一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，其特征在于，PCR检测采用50μL体系，包括2
×
Taq Mix 25μL，小于500ng的DNA模板1
‑
5μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，加无菌水至50μL。7.根据权利要求5所述的一种通...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦传新，孙美婧，郭禹，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：