一种复合微生物菌剂的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种复合微生物菌剂的构建方法；本方法利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。本发明专利技术得到的复合菌群在根际原位环境下结构稳定，有明显的促生效果。有明显的促生效果。

【技术实现步骤摘要】
一种复合微生物菌剂的构建方法


[0001]本专利技术涉及一种复合微生物菌剂的构建方法、该构建方法得到的复合微生物菌剂及其应用，属于合成生物学和生物肥料学领域。

技术介绍

[0002]生物肥料在我国土壤培肥改良、作物提质增产、化肥减施增效和资源化循环利用等方面发挥了至关重要的作用；在国家绿色农业发展和乡村振兴计划等战略中，生物肥料的基础研究、应用创新和产业发展已成为新时期的重点发展目标。我国的生物肥料产业经过近20年的稳定快速发展，目前获得农业农村部登记的微生物肥料产品有9200余个，有效登记证8385个，其中微生物菌剂类产品4335个，生物有机肥2460个，复合微生物肥料1590个；使用的功能菌种已达到200余种，年产量超过3000万吨，应用面积超5亿亩以上，年产值能达400亿元以上；全国微生物肥料企业约有2800多家。
[0003]传统的单一菌种微生物肥料养分功能单一、田间效果不稳定，无法满足农业生产中多元素平衡供应、促进植物生长、拮抗土传病害等的综合需求。另一方面，随着微生物组和合成生物学技术的快速发展，基于合成微生物学的原理和技术构建结构稳定的多功能合成菌群微生物肥料既是科学发展的前沿也是产业更新换代的发展的方向。目前对于合成菌群的构建策略主要分为两种：在自然界中获取已经稳定的核心菌群，即从上到下(Top
‑
Down)的策略；根据已有的知识，理性设计人工合成稳定菌群，即从下到上(Bottom
‑
up)的策略。
[0004]传统微生物菌剂复配的从上到下(Top<br/>‑
Down)方法大多是从自然界中获取稳定的菌群，缺点是菌群内部成员大多未知，研究群落成员内部协同互作关系难度较大；传统的从下到上(Bottom
‑
up)方法大多直接将各类功能的微生物简单配伍并最终验证复合菌剂的功能，在构建菌群时并未过多的体现理性设计原则，缺点是无法有效的整合现有技术方法，理性高效的设计复合菌剂。
[0005]本专利技术利用系统生物学中的基于约束的代谢建模方法，选择优异的肥效微生物菌种，结合从上到下的策略构建微生物之间可以协同增效、代谢互补的合成菌群微生物肥料，引领微生物肥料新产品开发方向。

技术实现思路

[0006]为了解决单一菌种微生物肥料功能单一、及田间效果不稳定以及从上到下(Bottom
‑
up)方法效率低，无法体现理性设计原则等问题，本专利技术的第一个目的是提供一种复合微生物菌剂的构建方法；第二个目的是提供上述构建方法构建得到的复合微生物菌剂；第三个目的是提供上述复合微生物菌剂作为实际生产中微生物肥料的应用。本专利技术基于合成生物学领域的合成菌群学原理，应用约束代谢模型重建方法，构建了多功能、生态稳定的复合微生物菌剂，本专利技术的复合微生物菌剂在接入植物根际土壤之后群落内部成员能保持相对稳定的状态，并显著促进植物生长。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种复合微生物菌剂的构建方法，利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。
[0009]本专利技术还保护前文所述的构建方法构建得到的复合微生物菌剂。
[0010]所述的复合微生物菌剂中每株菌都进行了全基因组测序，并获取了基因组全图，利用合成生物学与系统生物学中的基于基因组约束代谢建模的技术对合成菌群中的每株菌进行代谢模型的构建，并预测菌群内部潜在的互作关系。
[0011]作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂的活性成分选自纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)(又称纤维化纤维微菌Cel_cel)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(又称施氏假单胞菌Pse_stu)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(又称荧光假单胞菌Pse_flu)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)(又称巴西固氮螺菌Azo_bra)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(又称巨大芽孢杆菌Bac_meg)中的任意2种或2种以上。
[0012]其中，所述解淀粉芽孢杆菌为SQR9。
[0013]作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂的活性成分选自1)
‑
5)中任一种：
[0014]1)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
[0015]2)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；
[0016]3)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
[0017]4)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
[0018]5)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
[0019]优选的，所述所述复合微生物菌剂的活性成分选自A)
‑
C)中任一种：
[0020]A)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；
[0021]B)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合微生物菌剂的构建方法，其特征在于，利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。2.权利要求1所述的构建方法构建得到的复合微生物菌剂。3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的活性成分选自纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）中的任意2种或2种以上。4.根据权利要求2或3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的活性成分选自1）
‑
5）中任一种：1）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）；2）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；3）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）；4）纤维化纤维微细菌（Cellulos...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞福，王伟，许欢欢，李森，徐志辉，张楠，荀卫兵，缪有志，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：