一种γ-氨基丁酸高产生物制备法制造技术

本发明专利技术涉及一种γ

【技术实现步骤摘要】
一种
γ
‑
氨基丁酸高产生物制备法


[0001]本专利技术属于γ
‑
氨基丁酸合成
，具体涉及一种用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶及所述生物合成酶在γ
‑
氨基丁酸生物制备中的应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]γ
‑
氨基丁酸(别名4
‑
氨基丁酸，γ
‑
aminobutyric acid，简称GABA)，是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，其拥有良好的水溶性与热稳定性，具备改善机体睡眠质量、降血压等生理功效，可用于饮料等食品的添加。
[0004]γ
‑
氨基丁酸的生物合成方法以谷氨酸(Glu)或其盐类为底物通过谷氨酸脱羧酶合成GABA为主。目前，谷氨酸脱羧酶主要来源于微生物，其中，乳酸菌属于食品安全级别的微生物，并且具有促进营养吸收、改善肠道内环境及抑制致病菌增殖等生理活性，成为γ
‑
氨基丁酸合成的首选。针对上述研究背景，专利技术人认为，采用微生物发酵合成涉及较为复杂的后处理步骤，并且对微生物的热稳定性具有较高的要求，生物酶催化法能够显著提高GABA的安全性，更加适用于食品、药品行业。

技术实现思路

[0005]基于上述研究背景，本专利技术目的在于提供一种γ<br/>‑
氨基丁酸高产生物制备法，基于该技术目的，本专利技术针对谷氨酸脱羧酶进行了优化。在针对谷氨酸脱羧酶的优化思路中，本专利技术除了筛选有益的突变位点外，还联想到对谷氨酸脱羧酶中高活性区域进行筛选，以期望获得一种高催化活性，同时序列更短的酶产品。
[0006]基于上述技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面，提供一种用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶，所述生物合成酶具有如下的氨基酸序列：
[0008](1)如SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示的氨基酸序列；
[0009](2)SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸增加、缺失或替换后还具有相同或相似生理活性的氨基酸序列。
[0010]上述(1)所述氨基酸序列的生物合成酶中，优选的生物合成酶具有SEQ ID NO:3
‑
6中任一项所述的氨基酸序列；进一步优选的方案中，为SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
[0011]本专利技术设计通过物理诱变的方式诱导短杆乳酸菌突变，并筛选发生在谷氨酸脱羧酶中可稳定遗传的突变位点构建谷氨酸脱羧酶突变体，以期望获得一种性能改进的γ
‑
氨基丁酸生物合成酶。
[0012]另外，考虑到获得一种序列更加简短的多肽产品在工业生产方面具有诸多优势：获得小分子肽能够显著提高制备效率，甚至可通过固相合成、液相合成等更加精确的手段
进行制备；在制备固定化酶产品时，同样比表面积的载体，采用小分子肽可以结合更多的酶产品，提高催化效率等。本专利技术还尝试对谷氨酸脱羧酶中具有催化活性的位点进行筛选，将野生型谷氨酸脱羧酶中的高活性区域作为生物合成酶加以应用，以期望获得一种序列更加简短的生物酶产品。上述序列中的SEQ ID NO:5或6其催化性能相比野生酶具有显著的提升，并且氨基酸序列长度显著降低，应用于工业生产具有更大的应用优势。
[0013]上述(2)所述的生物合成酶相比SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示氨基酸序列的多肽具有一个或多个氨基酸增加、缺失或替换；优选的，所述多个为2～50个，进一步的，为2～30个；更进一步的，为2～10个。
[0014]一种实施方式中，所述增加、缺失或替换后的氨基酸序列与SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示的氨基酸序列具有90％及以上的相似性，所述相似性的可采用blast进行判断。
[0015]本专利技术第二方面，提供编码第一方面所述生物合成酶的基因序列。
[0016]本专利技术第三方面，提供一种表达盒，所述表达盒包括第二方面所述基因序列。
[0017]本专利技术第四方面，提供一种重组载体，所述重组载体中包括第三方面所述表达盒或第二方面所述基因序列的完整编码阅读框序列。
[0018]优选的，所述载体包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。
[0019]进一步优选的，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
[0020]本专利技术第五方面，提供一种表达第一方面所述γ
‑
氨基丁酸生物合成酶的宿主细胞。
[0021]所述宿主细胞优选高表达谷氨酸脱羧酶的菌株，如短乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌或德式乳杆菌；进一步的，为短乳杆菌。
[0022]本专利技术第六方面，提供一种γ
‑
氨基丁酸高产生物制备方法，所述制备方法包括采用第一方面所述用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶转化L
‑
谷氨酸。
具体实施方式
[0023]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0024]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0025]正如
技术介绍
所介绍的，提供一种γ
‑
氨基丁酸的生物催化方法具有使用安全、高效等技术优势，为了解决如上的技术问题，本专利技术针对乳酸菌的谷氨酸脱酸酶进行了优化，获得一种性能更加优化的谷氨酸脱羧酶。
[0026]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本专利技术的技术方案。
[0027]实施例1
[0028]本实施例中所述诱变菌株的出发菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，为
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，菌株保藏编号为CICC 20014。
[0029]1、高产γ
‑
氨基丁酸菌株诱变及突变位点筛选
[0030]MRS液体培养基：蛋白胨8g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏3.5g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，吐温
‑
80 1g/L，柠檬酸三钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.1g/L，余量为水，pH值为6.0～7.0；120℃，15min灭菌备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶，其特征在于，所述生物合成酶具有如下的氨基酸序列：(1)如SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸增加、缺失或替换后还具有相同或相似生理活性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶，其特征在于，所述生物合成酶具有SEQ ID NO:3
‑
6中任一项所述的氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。3.如权利要求1所述用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶，其特征在于，所述“多个”为2～50个，进一步的，为2～30个；更进一步的，为2～10个。4.如权利要求3所述用于γ
‑
氨基丁酸生物合成酶，其特征在于，所述增加、缺失或替换后的氨基酸序列与SEQ ID NO:1
‑
6任一项所示的氨基酸序列具有90％及以上的相似性，所述相似性的采...

【专利技术属性】
技术研发人员：许向阳，王鹏，宋在伟，宋均营，黄家超，殷允超，王昌斌，
申请(专利权)人：枣庄市杰诺生物酶有限公司，
类型：发明
国别省市：