包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增如下8种呼吸道病原体的9个基因位点的特异性扩增引物；其中，9个基因位点为：2019新型冠状病毒的ORF和N基因，甲型流感病毒的血凝素基因，乙型流感病毒的M蛋白基因，腺病毒的Hexon基因Loop1上游区段，副流感病毒的血凝素

【技术实现步骤摘要】
包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子诊断
，涉及一种涵盖新型冠状病毒和其他7种呼吸道病原体的检测试剂盒，具体为包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)感染初期症状主要有发热、全身疼痛、乏力等，与其他呼吸道病原体如甲型流感病毒(InfluenzaA)、乙型流感病毒(InfluenzaB)、腺病毒(HAdv)、副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(HRSV)等症状较为相似。
[0003]我国目前诊断呼吸道病毒感染的检测方法主要有：1)培养法；2)质谱法；3)免疫学检测；4)PCR法等。其中，获得病原体的活体(对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性)，是感染性疾病诊断的金标准。但是体外培养在感染的早期经常呈现阴性结果，而且病原体的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，绝大多数病毒难培养、难鉴定，检出率低。免疫学方法，如中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法、酶标斑点免疫法等，操作简单，但是由于病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足临床需求。质谱法具备高效、灵敏的优势，但是检测依赖昂贵的仪器设备，且需要极为专业的操作人员，难以大规模推广使用。随着分子生物学的进步，PCR技术的发展为病原的鉴定与分型提供了新的选择。但是对于未知病原体感染及多病原的混合感染，常规PCR方法往往需要进行多次扩增筛选，相对费时、费力。多重qPCR方法以其高灵敏和高特异性的特点，在未知病原体感染及多病原的混合感染检测中具有较为明显的优势，是目前较为成熟的病原体检测手段。
[0004]目前国内呼吸道病毒多重检测的试剂盒产品较少，博奥晶芯八项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)，中帜生物三项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(双扩增法)和七项呼吸道病原体核酸检测试剂盒均获批上市，但上述产品均不包含新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)检测靶点。而国外也没有关于新型冠状病毒SARS
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CoV
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2及其他不同种呼吸道病毒同时检测的核酸检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种能够同时检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2及其他不同种呼吸道病毒的方法，即：可对2019新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)、甲型流感病毒(InfluenzaA、InfluenzaA H1N12009、InfluenzaA H3N2)、乙型流感病毒(InfluenzaB)、腺病毒(HAdV)、副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(HRSV)、鼻病毒(HRV)、肺炎支原体(MP)八种病原体进行定性分析。鉴于此，本专利技术提供了包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒及其应用。
[0006]技术方案：包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增如下8种呼吸道病原体的9个基因位点的特异性扩增引物；其中，9个基因位点为：2019新型冠状病毒的ORF和N基因，甲型流感病毒的血凝素基因，乙型流感病毒的M蛋白基因，腺病毒的Hexon基因Loop1上游区段，副流感病毒的血凝素
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神经氨酸酶基因，呼吸道合胞病毒的F蛋白基
因，鼻病毒的VP1衣壳蛋白基因，肺炎支原体的16S rRNA基因；以及内参基因ACTB的特异性扩增引物。
[0007]优选的，所述特异性扩增引物的序列如下：SARS
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CoV
‑2‑
ORF、SEQ ID NO.1
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2；SARS
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CoV
‑2‑
N、SEQ ID NO.4
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5；HRSV、SEQ ID NO.7
‑
8；InFA、SEQ ID NO.10
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11、InFB、SEQ ID NO.13
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14；HPIV、SEQ ID NO.16
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17；HAdV、SEQ ID NO.19
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20；HRV、SEQ ID NO.22
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23；MP、SEQ ID NO.25
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26；ACTB、SEQ ID NO.28
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29。
[0008]优选的，所述特异性扩增引物的使用终浓度为：SARS
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CoV
‑2‑
ORF：0.32μM，SARS
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CoV
‑2‑
N：0.4μM，HRSV：0.3μM，InFA：0.3μM，InFB：0.4μM，HPIV：0.3μM，HAdV：0.3μM，HRV：0.35μM，MP：0.32μM，ACTB：0.4μM。
[0009]优选的，所述8种呼吸道病原体的9个基因位点以及内参基因ACTB均设计1条简并探针，探针序列如下：SARS
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CoV
‑2‑
ORF、SEQ ID NO.3；SARS
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CoV
‑2‑
N、SEQ ID NO.6；HRSV、SEQ ID NO.9；InFA、SEQ ID NO.12、InFB、SEQ ID NO.15；HPIV、SEQ ID NO.18；HAdV、SEQ ID NO.21；HRV、SEQ ID NO.24；MP、SEQ ID NO.27；ACTB、SEQ ID NO.30。
[0010]优选的，所述探针的使用终浓度为：SARS
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CoV
‑2‑
ORF：0.24μM，SARS
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CoV
‑2‑
N：0.2μM，HRSV：0.2μM，InFA：0.1μM，InFB：0.3μM，HPIV：0.3μM，HAdV：0.2μM，HRV：0.25μM，MP：0.25μM，ACTB：0.4μM。
[0011]表1特异性扩增引物和探针的序列及浓度
[0012][0013][0014]表2包含新冠的8种呼吸道病原体特异性扩增引物的组合设计
[0015][0016][0017]表3组合A特异性扩增引物的使用终浓度
[0018][0019]表4组合B特异性扩增引物的使用终浓度
[0020][0021]表5组合C特异性扩增引物的使用终浓度
[0022][0023]优选的，所述探针采用TaqMan探针设计，其中SARS
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CoV
‑2‑
ORF、InFA、HAdV采用FAM荧光标记，猝灭基团选择BHQ1；SARS
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CoV
‑2‑
N、InFB、HRV采用HEX荧光标记，猝灭基团选择BHQ1；HRSV、HPIV、MP采用ROX荧光标记，猝灭基团选择BHQ2；ACTB采用Cy5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增如下8种呼吸道病原体的9个基因位点的特异性扩增引物；其中，9个基因位点为：2019新型冠状病毒的ORF和N基因，甲型流感病毒的血凝素基因，乙型流感病毒的M蛋白基因，腺病毒的Hexon基因Loop1上游区段，副流感病毒的血凝素
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神经氨酸酶基因，呼吸道合胞病毒的F蛋白基因，鼻病毒的VP1衣壳蛋白基因，肺炎支原体的16S rRNA基因；以及内参基因ACTB的特异性扩增引物。2.根据权利要求1所述的包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的序列如下：SARS
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CoV
‑2‑
ORF、SEQ ID NO.1
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2；SARS
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CoV
‑2‑
N、SEQ ID NO.4
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5；HRSV、SEQ ID NO.7
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8；InFA、SEQ ID NO.10
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11、InFB、SEQ ID NO.13
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14；HPIV、SEQ ID NO.16
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17；HAdV、SEQ ID NO.19
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20；HRV、SEQ ID NO.22
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23；MP、SEQ ID NO.25
‑
26；ACTB、SEQ ID NO.28
‑
29。3.根据权利要求2所述的包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的使用终浓度为：SARS
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CoV
‑2‑
ORF：0.32μM，SARS
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CoV
‑2‑
N：0.4μM，HRSV：0.3μM，InFA：0.3μM，InFB：0.4μM，HPIV：0.3μM，HAdV：0.3μM，HRV：0.35μM，MP：0.32μM，ACTB：0.4μM。4.根据权利要求1所述的包含新冠的8种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述8种呼吸道病原体的9个基因位点以及内参基因ACTB均设计1条简并探针，探针序列如下：SARS
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CoV
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【专利技术属性】
技术研发人员：何小用，陈林丽，张雷，胡琦，赵鹏，王伟，黄银花，
申请(专利权)人：无锡中德美联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：