优化的高产率表达多肽的表达盒制造技术

提供了优化的高产率表达多肽的表达盒。具体提供了一种稳定转染有至少一种表达盒和/或至少一种表达载体的CHO宿主细胞，其中所述至少一种表达盒和/或至少一种表达载体整合入所述宿主细胞的基因组，所述表达盒用于表达目标多肽，所述表达盒包括包含SEQ ID NO:1、2或7的5

【技术实现步骤摘要】
优化的高产率表达多肽的表达盒


[0001]本专利技术尤其涉及适于表达目标多肽的表达盒，其中所述表达盒包括特定的5
’
UTR和hCD33分泌性前导序列的组合。发现此遗传元件的特定组合意外地引起目标多肽表达水平显著优于其它5
’
UTR与其它分泌性前导序列的组合。因此，使用此表达盒有利于高产率生成目标多肽。

技术介绍

[0002]大量克隆和表达目标多肽的能力变得越来越重要。生成和纯化高水平蛋白的能力对于人用药物和生物
，例如合成蛋白药物以及基础研究例如结晶蛋白以能测定其三维结构尤其重要。其他情况下难以获得一定量的蛋白能在宿主细胞中过表达且随后被分离和纯化。
[0003]选择生成重组蛋白的表达系统取决于多种因素，包括目标蛋白的细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和生物活性以及产生治疗性蛋白的调节问题和经济考虑。哺乳动物细胞相比其它表达系统如细菌或酵母的关键优势是完成合适蛋白折叠、复杂N
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连接糖基化和真O
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连接糖基化的能力以及广谱的其它翻译后修饰。由于所述优势，真核且特别是哺乳动物细胞是目前用于生成复合治疗性蛋白如单克隆抗体的表达系统的选择。
[0004]获得高表达宿主细胞(也称为高生产子)的最常见方法以产生合适表达载体以表达目标产物作为第一步。所述表达载体驱动编码目标产物的多核苷酸在宿主细胞内表达且通常包括至少一个选择标记以产生重组细胞系。除了编码目标蛋白的多核苷酸，用于在宿主细胞内表达多肽的表达载体通常还包括适于驱动转录的转录控制元件作为表达盒元件，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。此外，一般包括适当翻译控制元件且操作性连接待表达的多核苷酸，如合适的5
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UTR和3
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UTR。
[0005]为增加所述表达系统的效率，优化不同元件，尤其是有助于转录和翻译效率、蛋白合成、ER内正确折叠和蛋白分泌的DNA序列。没有经优化翻译和分泌组件的高产率表达系统可能导致mRNA不稳定、蛋白质分泌不足、错折叠(失活)蛋白积聚于细胞质或膜中。因此，对能稳定和持续翻译并分泌正确折叠蛋白进入细胞培养基的表达系统尤其感兴趣。这种分泌系统提供以下优势：稳定和有效的mRNA翻译；正确的蛋白折叠和有效分泌，简单且快速的产物纯化过程，以及相较胞质系统产率提高。然而，多数可用分泌系统的产物产率尚未充分优化。为提高生产率和分泌效率，一个目标是优化分泌信号(本文也称为信号肽或分泌性前导序列)以及其与不同5
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UTR序列的组合，从而获得产生所需高水平表达的遗传元件组合。
[0006]来自原核或真核生物的大部分分泌和膜结合蛋白具有氨基末端前导肽(也称为分泌性前导序列或信号肽)，其在生物合成期间从新生前体多肽中切割。分泌性前导序列通常长度为5
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60个氨基酸。此序列对于分泌而言是必须且充足的。分析大量这类分泌性前导序列显示在没有显著氨基酸序列同源性的情况下出现的共同结构基序[Von Heijne,1981；Perlman等,1983]。一般，分泌性前导序列由带正电荷的氨基末端(n)、疏水核(h)和极性更
高的定义信号肽酶切割位点的羧基末端(c)组成。分泌性前导序列的“n”区长度为约5
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8个氨基酸且特征为存在碱性残基。“h”区包含8
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12个非极性氨基酸，其平均构成为37％亮氨酸、15％丙氨酸、10％缬氨酸、10％苯丙氨酸、7％异亮氨酸和21％疏水氨基酸如甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸。此区域形成α
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螺旋的倾向高，所述构象可促进与脂双层内部的相互作用。对分泌性前导肽结构特征的研究主要基于细菌蛋白，表明“h”区对信号序列功能关键[Gierasch,1990]。通过缺失或者疏水残基被亲水或带电氨基酸取代来破坏h区可导致信号功能损失，而改变“n”区的影响不大[Bird等,1990]。羧基末端或切割区通常长度为约6个氨基酸。该区域参与信号肽酶识别和切割，一般需要其来实现蛋白的最终折叠和分泌。
[0007]5’
UTR(5
’
非翻译区)是转录成mRNA而非蛋白的DNA序列部分。其通常始于转录起始，终止于起始密码子前的一个核苷酸。5
’
UTR可包含调节翻译效率或mRNA稳定性、蛋白结合位点、调控元件的序列，以及促进翻译起始的序列。5
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UTR序列的长度可变且能包括几十个核苷酸到多至数百或甚至数千个核苷酸。真核生物中，5
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UTR的中值长度是约100
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200nt。5
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UTR和其元件的特定作用尚未充分阐明，部分也是因为所述序列不被翻译为功能蛋白。然而，已知特定5
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UTR和特定分泌性前导序列的组合能大幅提高生产系统的翻译和分泌效率，因此可增加表达产率。然而，由于有过多的5
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UTR和分泌性前导序列可用，获得能确实提高表达的有效组合是一个挑战。因此，尽管有很多的可用表达盒和表达载体，在真核细胞中获得高产率的稳健多肽/蛋白生成仍是挑战。
[0008]因此，本专利技术的目的是提供表达盒，当所述表达盒引入宿主细胞时其能以高产率分泌目标多肽。此外，本专利技术的一个目的是提供能以高产率表达目标多肽的表达载体。此外，本专利技术的一个目的是提供适于高产率表达目标多肽的方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术是基于以下发现：在一个表达盒内组合特定5
’
UTR多核苷酸序列(参见SEQ ID NO:1，其也包含于SEQ ID NO:2、3和4以及5、6和7中)与人CD33分泌性前导序列使得所述表达盒所编码目标多肽的表达高得惊人。在一些示例中，显示本专利技术所述表达盒优于现有技术已知的表达盒，因为表达产率增加可多至4倍。本专利技术所述表达盒的优越性能在许多实验中得到确认，其中不同目标多肽从所述表达盒中表达。因此，本专利技术所述表达盒对于高产率生成目标多肽特别有利。另外，发现前导序列的正确加工可被改善。因此，本专利技术为本领域作出有价值的贡献，因为此新型表达盒设计显著提高目标多肽的表达。
[0010]根据第一方面，本专利技术提供表达目标多肽的表达盒，所述表达盒包括：
[0011]a)启动子
[0012]b)5
’
UTR多核苷酸序列，其中所述5
’
UTR多核苷酸序列选自下组
[0013]i)包括以下序列的5
’
UTR多核苷酸序列
[0014][0015]ii)包括以下序列的5
’
UTR多核苷酸序列
[0016][0017]iii)包括以下序列的5
’
UTR多核苷酸序列
[0018][0019]iv)包括以下序列的5
’
UTR多核苷酸序列
[0020][0021]v)包括以下序列的5
’
UTR多核苷酸序列
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定转染有至少一种表达盒和/或至少一种表达载体的CHO宿主细胞，其中所述至少一种表达盒和/或至少一种表达载体整合入所述宿主细胞的基因组，且其中a)所述表达盒用于表达目标多肽，所述表达盒包括：aa)启动子；ab)由选自下组的序列组成的5
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UTR多核苷酸序列：i)包含如下序列的5
’
UTR多核苷酸序列：agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgca(SEQ ID NO：1)；ii)包含如下序列的5
’
UTR多核苷酸序列：agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg(SEQ ID NO：2)；iii)包含如下序列的5
’
UTR多核苷酸序列：agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO：7)；ac)编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸，其中，所述hCD33分泌性前导序列由序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO 12)组成；和ad)编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点；且b)所述表达载体是用于表达目标多肽的表达载体，包括至少一种如a)的表达盒。2.如权利要求1所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达盒还包括ae)3
’
UTR序列和/或af)多聚A信号。3.如权利要求1或2所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达盒具有一个或多个以下特征：i)所述编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的2个或更多亚基或结构域作为目标多肽，其中至少一个IRES元件位于各亚基或结构域的编码区之间且各编码区之前是hCD33分泌性前导序列；ii)所述编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的亚基或结构域作为目标多肽；iii)所述编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或者其功能片段或衍生物的重链或轻链作为目标多肽；
iv)所述表达盒适于以高产率表达目标多肽；v)所述5
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UTR多核苷酸序列由SEQ ID NO：1组成且所述编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或其功能片段或衍生物的重链作为目标多肽；vi)所述5
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UTR多核苷酸序列由SEQ ID NO：7组成；vii)所述5
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UTR多核苷酸序列包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7组成且所述编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或其功能片段或衍生物的重链作为目标多肽；viii)所述表达盒是单顺反子表达盒；ix)所述表达盒中包含的启动子是人CMV启动子，其选自下组：ix a)包括以下序列的启动子或其担任启动子的功能片段；ix b)包含与SEQ ID NO 8所示序列或其担任启动子的功能片段至少80％同一的序列的启动子。4.如权利要求2或3的CHO宿主细胞，其中所述表达盒包括以下元件：aa)人CMV启动子；ab)由SEQ ID NO：7组成的5
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【专利技术属性】
技术研发人员：Z，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：