一种重组牛干扰素融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组牛干扰素融合蛋白，包含牛扰素α和蓖麻毒素B链，所述牛扰素α为牛干扰素突变体蛋白mBoIFNα，所述蓖麻毒素B链为截短的蓖麻毒素B链蛋白RTBD1，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白，优选的将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第32位和/或第83位氨基酸突变为精氨酸或组氨酸。本发明专利技术提供的牛干扰素重组融合蛋白比普通牛干扰素α半衰期长、生物学活性高，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。兽医临床应用的巨大潜力和价值。兽医临床应用的巨大潜力和价值。

【技术实现步骤摘要】
一种重组牛干扰素融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及由牛干扰素α重组蛋白及其制备方法。

技术介绍

[0002]干扰素(Interferon，IFN)是机体在感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应从而产生的糖蛋白，干扰素在抗病毒复制活性上具有突出优势，可以增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型干扰素还可分为IFN
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α、IFN
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β和IFN
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α，Ⅰ型干扰素抗病毒活性较强。
[0003]目前大型哺乳动物Ⅰ型干扰素类细胞因子药物应用发展进程较慢。现有的牛干扰素多属于单一的α型或β型，但在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，研制安全有效的牛IFN
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α融合蛋白制剂具有重大意义。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术中的不足本专利技术提供了一种重组牛干扰素融合蛋白，包含牛扰素α和蓖麻毒素B链，所述牛扰素α为牛干扰素突变体蛋白mBoIFNα，所述蓖麻毒素B链为截短的蓖麻毒素B链蛋白RTBD1，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。分别对于野生型和突变蛋白做柔性分析,如果突变区域蛋白柔性提升，则将该区域的一个或几个氨基酸作为突变位点，突变为极性氨基酸。
[0005]所述极性氨基酸具有亲水性，提高蛋白等电点和稳定性，通过本专利技术所选择的位点进行突变，改变了天然蛋白的二硫键，制备得到的突变蛋白在保存过程中不易产生沉淀。本专利技术所选择的突变位点，突变蛋白与野生型蛋白相比，三维结构没有发生变化，从而维持了蛋白的生物学功能。
[0006]优选的是，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第32位和/或第83位氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。
[0007]上述任一项优选的是，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
[0008]上述任一项优选的是，其特征在于，所述RTBD1的氨基酸序列为Seq ID NO：2所示氨基酸序列中的第n位至m位氨基酸，其中n＝1，2，3或4，m≥134。
[0009]蓖麻毒素B链(Ricin toxin，RTB)没有毒性且具有增强机体免疫反应的功能。本专利技术进一步优选的将牛IFNα与RTBD1截短肽组成融合蛋白获得长效牛干扰素，可增强牛干扰素抗病毒活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。优选的，所述蓖麻毒素B链蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：2所示的氨基酸序列，优选的，使用截短的蓖麻毒素B链蛋白，截短方式包括将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第1位氨基酸敲除、第1、2位氨基酸敲除、第1至3位氨基酸敲除；和/或将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第135至263位氨基酸序列敲除、第136至263位氨基酸序列敲除、第137至263位氨基酸
序列敲除、第138至263位氨基酸序列敲除、第139至263位氨基酸序列敲除、第140至263位氨基酸序列敲除、
……
、第260至263位氨基酸序列敲除、第261至263位氨基酸序列敲除、第262至263位氨基酸序列敲除、第263位氨基酸序列敲除。本专利技术所优选的蓖麻毒素B链截短肽减小蛋白分子大小，增加在体内组织的渗透率。
[0010]上述任一项优选的是，截短的蓖麻毒素B蛋白为RTBD1，RTBD1的氨基酸序列如Seq ID NO：18所示。
[0011]上述任一项优选的是，所述融合蛋白包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
[0012]本专利技术还提供了一种编码所述融合蛋白的基因，所述基因序列包含如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列。
[0013]本专利技术还提供了一种含有所述基因的重组载体。
[0014]本专利技术还提供了一种含有所述重组载体的基因工程菌，将所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
[0015]本专利技术还提供了一种制备上述任一项所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：步骤一、mBoIFNα/RTBD1突变载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组mBoIFNα/RTBD1融合蛋白表达；步骤四、纯化与复性。
[0016]本专利技术还提供了上述任一项所述的融合蛋白在抗病毒药物中的应用。在制备牛抗病毒药物中的应用。
[0017]本专利技术提供一种牛干扰素重组融合蛋白及其制备方法和应用。
[0018]本专利技术优选的技术方案如下：
[0019]本专利技术的一种牛干扰素重组融合蛋白，该重组融合蛋白由牛干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成。优选的牛干扰素α为牛IFNα突变体蛋白mBoIFNα，氨基酸序列如Seq ID NO：17所示。优选的蓖麻毒素B链蛋白为截短的蓖麻毒素B链RTBD1，氨基酸序列如Seq ID NO：18所示。本专利技术含有牛IFNα突变体蛋白和RTBD1的重组融合蛋白命名为mBoIFNα/RTBD1。优选的，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。
[0020]本专利技术提供了一种牛干扰素重组融合蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：
[0021]步骤一、mBoIFNα/RTBD1突变载体构建；
[0022]步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
[0023]步骤三、重组mBoIFNα/RTBD1融合蛋白表达；
[0024]步骤四、纯化与复性。
[0025]作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
[0026](1)生物信息学分析BoIFNα潜在突变位点：通过在线公开数据库对牛干扰素α与牛I型干扰素受体进行同源建模，使用Z
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DOCK获得分子对接结构模型，对I型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点(突变位点的选择原则为：预测评估突变前后IFN与IFN受体间结合力的变化，推算蛋白三维结构维持的关键位点，再将众多非关键位点作为突变位点的候选进行不同天然氨基酸的定点突变，选择最终突变结果中结合力较高的位点与氨基酸)；
[0027](2)BoIFNα突变基因克隆载体构建：设计牛IFNα定点突变引物(引物名称和序列如下：F：Seq ID NO：5；R：Seq ID NO：6；PM1F:Seq ID NO：7；PM1R:Seq ID NO：8；PM2F:Seq ID NO：9；PM2R:Seq ID NO：10)，以实验室构建的pMD18T
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BoIFNα为模板(将Seq ID NO：19所示
的牛干扰素IFNα(BoIFNα)核苷酸序列构建于pMD18T载体得到pMD18T
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BoIFNα是本领域常规技术，在此不进行赘述)，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组牛干扰素融合蛋白，包含牛扰素α和蓖麻毒素B链，其特征在于，所述牛扰素α为牛干扰素突变体蛋白mBoIFNα，所述蓖麻毒素B链为截短的蓖麻毒素B链蛋白RTBD1，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述mBoIFNα是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第32位和/或第83位氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。4.如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述RTBD1的氨基酸序列为Seq ID NO：2所示氨基酸序列中的第n位至m位氨基酸，其中n＝1，2，3或4，m≥1...

【专利技术属性】
技术研发人员：许娜，王燕，石晶，
申请(专利权)人：长春萤火虫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：