一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡制造技术

本发明专利技术属于抗生素污染以及食品安全免疫检测领域，具体涉及一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡。该检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳。其NC膜上设置有C线和T线，C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，T线上包被有BSA

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡


[0001]本专利技术属于抗生素污染以及食品安全免疫检测
，具体涉及一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡。

技术介绍

[0002]诺氟沙星（NOR）是第三代喹诺酮类抗菌药，会阻碍消化道内致病细菌的DNA旋转酶的作用，阻碍细菌DNA复制，对细菌有抑制作用。诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。由于诺氟沙星抗生素在养殖业中的滥用，导致了动物性食品中诺氟沙星抗生素的残留。动物性食品中的诺氟沙星抗生素残留不仅会导致光毒性，也会导致耐药性的产生。同时，动物性食品中诺氟沙星的残留会影响奶制品的质量，随着人食用奶制品会严重威胁人们健康。中国农业部已经明令禁止一些抗生素在养殖业中的使用。此外，在食品安全检测中它可以作为评价食品产品质量的一项重要指标。因此需要高灵敏，高通量的检测技术来实现对于诺氟沙星抗生素的检测显得尤为重要。
[0003]目前，检测样品中诺氟沙星含量的方法主要包括毛细血管电泳法、电化学免疫传感器、高效液相色谱法等方法。这些方法都利用分析化学的检测手段对样品进行分离鉴定，可以实现诺氟沙星的定量检测。然而，这些方法的操作都需要实验室技术人员的操作以及对样品的预处理，有些还会用到昂贵的实验仪器，因此对样品中诺氟沙星的快速检测带来了一定的困扰。抗原抗体反应具有比例性，可逆性和高度的特异性，因此可以被用作免疫检测以及免疫诊断，目前已经被广泛应用于免疫印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫胶体和纳米花金层析技术（GICA）。应用纳米花金标免疫检测卡可以对诺氟沙星进行快速大批量的定性和半定量检测，而且不需要对样品进行前处理，从而省去了繁琐的步骤和样品处理时间。与其他化学检测方法相比较而言，该检测卡具有灵敏度高，特异性强，快速，简便等特点，被广泛应用于食品安全检测中。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡。利用该检测卡检测样品中的诺氟沙星，缓解了现有技术中缺少一种快速检测诺氟沙星的症结，将检测线和控制线划到同一个卡条上，装入包装壳，滴加微量检测样品等待5
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10分钟即可完成全部检测，结果肉眼可见，操作简单易行，且能保证检测卡的灵敏度，提高检测的准确性，避免污染环境，实现对诺氟沙星绿色环保的快速检测。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡，所述检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳；所述的NC膜上设置有C线和T线，所述的C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，所述的T线上包被有BSA
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NOR交联抗原；所述的金标垫上含有金纳米花标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1。
[0006]上述金标垫中所含有纳米花标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1的制备方法为：取10 mL纳米花金溶液，加入300 μL 0.1 M K2CO3溶液，混匀后备用；加入500 μL 抗诺氟沙星单克隆抗体5B1，于冰上继续搅拌30 min；称量0.1 g BSA并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min；称量0.1g PEG
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20000并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min待完全溶解后4℃静置过夜；4℃，1000 r/min离心10 min，收集上清中的纳米花金标抗体5B1，之后于4℃ 3000 r/min离心30 min，收集中间层蓝紫色流动相；向含有蓝紫色流动相中加入原来纳米花金标抗体5B1 1/10体积的纳米花金标稀释液，制得浓度为0.068 mg/mL的纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1溶液；纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆IgG抗体溶液以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上后干燥；所述纳米花金标稀释液：10 mL PBS+0.1g BSA+0.05 g PEG
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20000。
[0007]上述纳米花金溶液的制备方法为：用100 mL ddH2O溶解1 g HAuCl4制备获得1wt%的氯金酸水溶液，每管1 mL分装于1.5 mL灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于
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20℃保存备用；取1 mL 1wt%的氯金酸水溶液溶于100 mL ddH2O，混匀后加热煮沸，随后加入1.5 mL 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7 min；观察溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，放置室温冷却后，用无菌ddH2O定容至100 mL，即得到胶体金溶液，于4℃冰箱冷藏备用；取750 μL1wt%的氯金酸水溶液加入100 mL ddH2O中，加入500 μL上述制备的胶体金溶液混匀，再加入300 μL 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，最后加入1 mL 30 mM的对苯二酚溶液, 搅拌2 min即得到纳米花金溶液。所述纳米花金的溶液中纳米花金颗粒的最大吸收峰为570 nm。
[0008]上述抗诺氟沙星单克隆抗体5B1是由保藏编号为CGMCC NO. 21013的抗诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株5B1分泌获得；所述抗诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株5B1已于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0009]上述T线上包被的BSA
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NOR交联抗原，其制备方法为：将 1 mg 诺氟沙星用1 mL二甲基亚枫(DMSO)溶解后，加入 13 mg N
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羟基琥珀酰亚胺（NHS）和 38 mg 1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃条件下避光反应 24 h，4000 r/min离心 5 min后取上清液逐滴加入到 4 mL含 10 mg BSA的PBS缓冲液中，37℃条件下避光振荡反应 24 h，反应完用 PBS透析3 d，即获得BSA
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NOR交联抗原溶液；将0.05 mg/mL的BSA
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NOR交联抗原溶液，以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上后干燥。
[0010]所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由0.06 mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上后干燥。
[0011]上述基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡在诺氟沙星检测中的应用。
[0012]本专利技术的显著优点在于：通过竞争法纳米花金标免疫测流层析检测卡方法，对诺氟沙星进行快速检测，其检测灵敏度为39 ng/mL, 所建立的检测方法方便快捷可以直接用于实际样品中诺氟沙星的快速检测。
附图说明
[0013]图1 单克隆抗体5B1的腹水纯化结果鉴定。M：蛋白Marker；1泳道：腹水；2泳道：经过纯化后的单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡，其特征在于：所述检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳；所述的NC膜上设置有C线和T线，所述的C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，所述的T线上包被有BSA
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NOR交联抗原；所述的金标垫上含有纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1。2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡，其特征在于：所述金标垫上的纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1的其制备方法为：取10 mL纳米花金溶液，加入300 μL 0.1 M K2CO3溶液，混匀后备用；加入500 μL mAb，于冰上搅拌；称量0.1 g BSA并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌；称量0.1g PEG
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20000并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续至完全溶解后4℃静置过夜；离心收集上清中的纳米花金标抗体5B1，之后离心收集中间层蓝紫色流动相；向含有蓝紫色流动相中加入纳米花金标稀释液，制得浓度为0.068 mg/mL的纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1溶液；纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5B1溶液以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上后干燥；所述纳米花金标稀释液：10 mL PBS+0.1g BSA+0.05 g PEG
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20000。3.根据权利要求2所述的一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡，其特征在于：所述纳米花金溶液的制备方法为：用100 mL ddH2O溶解1 g HAuCl4制备获得氯金酸水溶液，取1 mL 1wt%的氯金酸水溶液溶于100 mL ddH2O，混匀后加热煮沸，随后加入1.5 mL 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热观察溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，放置室温冷却后，用无菌ddH2O定容至100 mL，即得到胶体金溶液；取750 μL1wt%的氯金酸水溶液加入100 mL ddH2O中，加入500 μL的胶体金溶液混匀，再加入300 μL 1wt%的柠檬...

【专利技术属性】
技术研发人员：王荣智，刘海梅，汪世华，赵学楠，李巧雅，高烨宏，凌素美，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：