细胞冻存试剂盒及其使用方法技术

本申请提出的一种细胞冻存试剂盒，包括第一冻存母液和第二冻存母液，第一冻存母液含有90g/L～110g/L的越橘提取物、90g/mL～110g/mL的羟乙基淀粉、180g/L～220g/L的右旋糖苷40；第二冻存母液含有90g/mL～110g/mL的脯氨酸、180g/mL～220g/mL的人血清白蛋白、270g/mL～330g/mL的右旋糖苷40。采用越橘提取物和脯氨酸为主要原料，有效降低细胞冻存过程中因冰晶形成对细胞造成的氧化应激损伤，能够使冻存后的细胞维持细胞活率、形态、增殖能力以及分化潜能，冻存后细胞生物学活性得到保持，冻存代数得到延长，提高了生物安全性和相容性。提高了生物安全性和相容性。提高了生物安全性和相容性。

【技术实现步骤摘要】
细胞冻存试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及细胞及生物工程领域，特别是涉及一种细胞冻存试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]干细胞是具有自我更新和多向分化的潜能的特殊细胞群体，包括如胚胎干细胞(embryonic stem Cell，ES)、诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)等，干细胞药物开发是当今最具潜力的生物医药产业方向。理论上，干细胞体外培养可保持数量持续增加，同时保留分化为其他类型细胞与器官的生物学潜能，这一特性使得干细胞药物的无限产出成为可能。但传统的干细胞持续性培养通常会导致其衰老和功能丧失，另一方面还将造成生产成本大幅升高，这些都成为限制干细胞产业开发的瓶颈。因此，避免体外持续性传代，将细胞种子长期保存并按需启动备份使用，成为更为合理的模式。
[0003]细胞冻存是使用最为广泛的长期保存技术，利用超低温环境降低代谢，达到长期储存的目的；冻存细胞可复苏并可活化为功能性细胞。干细胞具有来源珍贵、数量稀少、增殖代数有限等特征，冻存并按需求复苏使用，是其开发标准程序。但是低温冻存及复苏过程中会对细胞产生一定的损伤，主要有以下两类：(1)物理性损伤：细胞胞质的高水合性环境在冷冻与复苏过程中内产生大量冰晶，对内容物造成损害，进而导致细胞死亡。通常添加二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)等冷冻保护剂以抑制冰晶的形成。DMSO能渗透细胞膜进入胞内，增大渗透压，降低冰点，减少胞内冰晶形成；在特定浓度下(小于1％，体积分数)其毒性极小，且在胞内可快速代谢分解，是最为常用的保护剂。(2)化学损伤：氧化应激(Oxidation Stress,OS)是细胞在冻存复苏过程中所受到的最常见的化学损伤有害刺激条件下，产生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)，引起DNA损伤、基因突变、蛋白质变性并导致细胞死亡或生理学功能发生改变的现象。细胞反复冻融过程中会产生大量的ROS，在长期冻存的细胞中(12个月以上)，冻融复苏过程中产生的ROS是常规培养的5
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6倍。通常认为低浓度的DMSO是一种有效的ROS清除剂(ROS scavenger)。但是在高浓度下，DMSO(5
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10％细胞冻存时使用浓度)则呈相反的生物学效应；冻存复苏后星形胶质细胞ROS水平显著增加，凋亡率增高、生长异常，细胞数量和活力明显降低。干细胞冻存实验同样显示，冻存处理会显著提升胞内ROS水平(约5倍)，导致细胞活率下降；冻融产生的高浓度ROS会对细胞的克隆形成率，细胞分化潜能等干细胞的特有生物学功能降。
[0004]目前在世界范围内已经超过50种的干细胞类药物进入II期临床阶段。干细胞药物相对于传统药物的治疗周期明显加长，并且干细胞药物制备过程中会多次启动冷冻保存的种子备份，多次冻存复苏程序将产生累积性的冰晶、ROS损伤，对干细胞造成不可预见性的物理损伤和化学损伤。另一方面，作为细胞成药过程中的重要辅料成分，冻存体系的生物安全性及生物相容性已经成为了产品质控的重要环节。虽然现阶段DMSO仍被认为是最为有效的冻存保护剂；但是由于DMSO功能的两面性，对干细胞而言其不算是一种高生物亲和性物
质。因此，本领域亟需开发新的细胞冻存方案，以满足细胞成药技术对冻存细胞的细胞活性以及生物相容性的需求。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要针对传统的细胞冻存方法容易造成细胞损伤，并且生物安全性和相容性低的问题，提供一种细胞冻存试剂盒及其使用方法。
[0006]本申请提出了一种细胞冻存试剂盒，所述细胞冻存试剂盒包括第一冻存母液和第二冻存母液，所述第一冻存母液含有90g/L～110g/L的越橘提取物、90g/L～110g/L的羟乙基淀粉、180g/L～220g/L的右旋糖苷40；
[0007]所述第二冻存母液含有90g/L～110g/L的脯氨酸、180g/L～220g/L的人血清白蛋白、270g/L～330g/L的右旋糖苷40。
[0008]在其中的一个实施例中，所述第一冻存母液含有100g/L的越橘提取物、100g/L的羟乙基淀粉、200g/L的右旋糖苷40；
[0009]所述第二冻存母液含有100g/L的脯氨酸、200g/L的人血清白蛋白、300g/L的右旋糖苷40。
[0010]在其中的一个实施例中，所述细胞冻存试剂盒用于间充质干细胞的冻存前的冻存预处理和/或冻存后的复苏预处理。
[0011]本申请还提出了一种上述的细胞冻存试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
[0012]细胞冻存缓冲保护体系制备步骤，将所述细胞冻存试剂盒中的所述第一冻存母液和所述第二冻存母液按体积比(0.8～1.2)：10混合，制得细胞冻存缓冲保护体系；
[0013]冻存预处理步骤，将待冻存细胞于含有所述细胞冻存缓冲保护体系的细胞培养基中培养20h～28h。
[0014]在其中的一个实施例中，在所述细胞冻存缓冲保护体系制备步骤中，所述第一冻存母液和所述第二冻存母液按体积比为1：10混合。
[0015]在其中的一个实施例中，在所述冻存预处理步骤中，所述细胞冻存缓冲保护体系与所述细胞培养基的体积比为(0.8～1.2)：10。
[0016]在其中的一个实施例中，在所述冻存预处理步骤之后，还包括以下步骤：
[0017]细胞冻存悬液制备步骤，将所述待冻存细胞重悬于所述细胞冻存缓冲保护中，调整细胞浓度为1
×
106～5
×
106个细胞/mL，制得细胞冻存悬液；
[0018]冻存步骤，将所述细胞冻存悬液按照冻存程序进行冻存。
[0019]在其中的一个实施例中，在所述细胞冻存缓冲保护体系制备步骤之前，还包括以下步骤：
[0020]细胞冻存缓冲保护体系工作浓度确认步骤，将所述待冻存细胞重悬于添加不同体积比所述第一冻存母液的细胞培养基中培养100h～140h，根据培养后的所述待冻存细胞的活率确认所述第一冻存母液的工作浓度。
[0021]在其中的一个实施例中，所述使用方法还包括以下步骤：
[0022]复苏预处理步骤，将冻存后的冻存细胞于含有所述细胞冻存缓冲保护体系的复苏培养基中培养40h～56h。
[0023]在其中的一个实施例中，在所述复苏预处理步骤中，所述细胞冻存缓冲保护体系与所述复苏培养基的体积比为(0.8～1.2)：10。
[0024]上述细胞冻存试剂盒中，采用越橘提取物和脯氨酸作为主要原料，能有效降低细胞冻存过程中因冰晶形成对细胞造成的氧化应激损伤，能够使冻存后的细胞维持细胞活率、形态、增殖能力以及分化潜能，冻存后细胞生物学活性得到保持，冻存代数得到延长，并且以越橘提取物和脯氨酸替代传统的二甲基亚砜作为冷冻保护剂和抗氧剂，进一步提高了生物安全性和相容性。
附图说明
[0025]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述细胞冻存试剂盒包括第一冻存母液和第二冻存母液，所述第一冻存母液含有90g/L～110g/L的越橘提取物、90g/L～110g/L的羟乙基淀粉、180g/L～220g/L的右旋糖苷40；所述第二冻存母液含有90g/L～110g/L的脯氨酸、180g/L～220g/L的人血清白蛋白、270g/L～330g/L的右旋糖苷40。2.根据权利要求1所述的细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述第一冻存母液含有100g/L的越橘提取物、100g/L的羟乙基淀粉、200g/L的右旋糖苷40；所述第二冻存母液含有100g/L的脯氨酸、200g/L的人血清白蛋白、300g/L的右旋糖苷40。3.根据权利要求1或2所述的细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述细胞冻存试剂盒用于间充质干细胞的冻存前的冻存预处理和/或冻存后的复苏预处理。4.一种如权利要求1至3任意一项所述的细胞冻存试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：细胞冻存缓冲保护体系制备步骤，将所述细胞冻存试剂盒中的所述第一冻存母液和所述第二冻存母液按体积比(0.8～1.2)：10混合，制得细胞冻存缓冲保护体系；冻存预处理步骤，将待冻存细胞于含有所述细胞冻存缓冲保护体系的细胞培养基中培养20h～28h。5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，在所述细胞冻存缓冲保护体系制备步骤中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云虹，丁炜，柏小丽，黄芳蕾，万兴中，
申请(专利权)人：北京京蒙细胞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：