增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法技术

本发明专利技术公开了一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法。通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中，利用强启动子kasOp*分别增强表达安丝菌素体内靶标蛋白APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，得到高产安丝菌素的突变株HQG

【技术实现步骤摘要】
增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；尤其涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的转录水平以提高安丝菌素发酵水平的方法；通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中利用强启动子kasOp*增强表达内源的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，可以提高珍贵束丝放线菌的生物量，降低其胞内毒性，解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高安丝菌素产量。

技术介绍

[0002]安丝菌素是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C
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3位酯链上连接二硫键形成DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体
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药物偶联物(ADC)。目前，衍生于安丝菌素的多种ADC药物已经进入不同的临床检定阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine(即T
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DM1)已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真菌、酵母、昆虫等其它真核生物的生长与繁殖。
[0003]在安丝菌素的产生菌ATCC 31280的发酵过程中，安丝菌素会对细胞的生长和生理活动造成影响，此时，细胞的自身防护机制将会响应安丝菌素的进一步合成。通过化学蛋白质组学信息，我们找到了四个参与了安丝菌素合成相关的基因：APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307。增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达可以提高产生菌的生物量，降低安丝菌素对宿主的毒性，解除对安丝菌素合成的抑制，最终提高安丝菌素的产量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；本专利技术通过增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达水平以提高安丝菌素发酵水平，获得的高产安丝菌素的突变菌株(HQG
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01、HQG
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02、HQG
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03和HQG
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04)，基于增强表达内源安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，最终提高安丝菌素的产量。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0006]一方面，本专利技术提供一种提高安丝菌素发酵水平的方法，在珍贵束丝放线菌中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株，发酵获得安丝菌素；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765、APASM_6307中的一种或几种，其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
[0007]作为本专利技术的一个实施方案，所述珍贵束丝放线菌包括Actinosynnema pretiosum subsp.pretiosumATCC 31280。
[0008]进一步的，所述安丝菌素高产菌株由珍贵束丝放线菌ATCC 31280增强表达来源于
珍贵束丝放线菌ATCC 31280的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765或APASM_6307后获得。
[0009]作为本专利技术的一个实施方案，在ATCC 31280中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因具体包括如下步骤：
[0010]S1，设计并构建用于增强表达基因APASM_0666的整合型质粒I；
[0011]S2，设计并构建用于增强表达基因APASM_1807的整合型质粒II；
[0012]S3，设计并构建用于增强表达基因APASM_5765的整合型质粒Ш；
[0013]S4，设计并构建用于增强表达基因APASM_6307的整合型质粒IV；
[0014]S5，通过接合转移将整合型质粒I、II、Ш、IV分别导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并挑取菌丝体通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因表达突变株。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取882bp的APASM_0666基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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K*的NdeI/EcoRI位点。
[0016]作为本专利技术的一个实施方案，使用引物APASM_0666
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F/R，通过PCR扩增得到APASM_0666基因。
[0017]作为本专利技术的一个实施方案，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取861bp的APASM_1807基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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K*的NdeI/EcoRI位点。
[0018]作为本专利技术的一个实施方案，使用引物APASM_1807
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F/R，通过PCR扩增得到APASM_1807基因。
[0019]作为本专利技术的一个实施方案，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取729bp的APASM_5765基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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K*的NdeI/EcoRI位点。
[0020]作为本专利技术的一个实施方案，使用引物APASM_5765
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F/R，通过PCR扩增得到APASM_5765基因片段。
[0021]作为本专利技术的一个实施方案，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取993bp的APASM_6307基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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K*的NdeI/EcoRI位点。
[0022]作为本专利技术的一个实施方案，使用引物APASM_6307
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F/R，通过PCR扩增得到APASM_6307基因。
[0023]作为本专利技术的一个实施方案，受体菌株为珍贵束丝放线菌Actinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280。所述基因增强表达突变株依次记为HQG
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01、HQG
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02、HQG
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03、HQG
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04。
[0024]作为本专利技术的一个实施方案，所述发酵包含下列步骤：将安丝菌素体内靶标蛋白基因增强表达突变株(HQG
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01、HQG
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。10.一种用于增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体包含靶标蛋白基因为基因APASM_0666、...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，黄群刚，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：