一种β-葡萄糖苷酶荧光底物CFMU-Glu及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肠球菌是一种能够适应多种恶劣环境条件的革兰氏阳性、兼性厌氧菌。它是一种条件致病菌，在一定条件下可导致多种严重的人类疾病，例如尿路、腹腔内、盆腔和软组织感染，菌血症，感染性心内膜炎以及牙髓感染等。近些年来，肠球菌已成为医疗相关感染的第二大致病菌；其中，原被称为粪链球菌的粪肠球菌导致了大多数的肠球菌感染。因此，检测肠球菌尤其是粪肠球菌具有重要意义。
[0003]酶可作为检测目标菌的重要生物标记物或指示物。利用酶探针检测酶活性以检测目标菌的方法已引起了人们广泛的关注。其中，显色底物和荧光底物通常是最广泛应用的两类酶探针。已有研究表明荧光底物能给出比显色底物更高的检测灵敏度。目前，已被报道应用于检测肠球菌的荧光底物一般是4
‑
甲基伞形酮基
‑
β
‑
D
‑
葡萄糖苷(MU
‑
Glu)。然而，由于MU
‑
Glu产生的荧光物4
‑
甲基伞形酮(MU)具有较高的酸度系数(pK
a
)值(约7.8)，在生理pH值条件下只是部分离子化而导致产生的荧光信号强度会显著减弱，致使检测灵敏度降低；若加碱调高pH值，则会导致酶与底物的反应淬灭，从而不利于持续可视化监测、或者不利于获得更低的检测限。
[0004]在检测肠球菌时，仅仅依靠β
‑
葡萄糖苷酶探针，是难以获得高的检测特异性的。尽管结合选择性培养基是一种有效策略，但如何获得高的检测特异性和高的检测灵敏度，却是有待解决的。另外，在使用液体培养基培养细菌时，通常采取的是用试管装入较多的单倍料液体培养基和加入相对少量的待测样液，这种做法存在的不足包括：试剂耗用量和占用空间都较大，不便于大批量样品检测等。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu及其制备方法，和CFMU
‑
Glu在制备检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒中的应用，以及提供一种应用CFMU
‑
Glu的肠球菌检测方法，以实现肠球菌的特异、灵敏和快速检测。
[0006]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu，其结构式如式(I)所示：
[0008][0009]本专利技术的第二个目的是提供一种上述β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)向4
‑
氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的混合物中加入甲烷磺酸，室温或加热下搅拌反应一段时间，然后加入冰冷水搅拌，过滤，热水洗涤，将所得固体用等体积比的乙醇
‑
水混合液进行重结晶，得到白色结晶体目标产物CFMU；
[0011](2)向上述所得目标产物CFMU与碳酸铯的混合物中加入乙腈，室温下搅拌，加入四乙酰溴代
‑
α
‑
D
‑
葡萄糖，于室温下继续搅拌反应，旋蒸去除溶剂，加入二氯甲烷提取，依次用稀氢氧化钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，分液，用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸去除溶剂，将所得固体用等体积比的乙醇
‑
水混合液热浸泡，冷却后过滤，得到白色固体目标物aCFMU
‑
Glu；
[0012](3)向aCFMU
‑
Glu的无水甲醇悬浊液中加入催化量的氢氧化钾
‑
甲醇溶液，室温下搅拌反应，然后旋蒸浓缩，过滤，用冷甲醇洗涤，即可得到白色固体目标荧光底物CFMU
‑
Glu。
[0013]进一步地，步骤(1)中，所述的4
‑
氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1；所述的甲烷磺酸体积用量相对于4
‑
氯间苯二酚质量为3～15mL/g。
[0014]步骤(2)中，所述的CFMU、碳酸铯和四乙酰溴代
‑
α
‑
D
‑
葡萄糖的摩尔比为1.0:(1.1～2.5):(1.0～2.0)。
[0015]步骤(3)中，所述的aCFMU
‑
Glu和氢氧化钾的摩尔比为1.0:(0.1～0.2)。
[0016]步骤(1)中，所述的反应一段时间即为反应≤16h；步骤(2)中，所述的于室温下继续搅拌反应的反应时间为3h；步骤(3)中，所述的室温下搅拌反应的反应时间为1h。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供上述的β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu在制备检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
[0018]本专利技术的第四个目的是提供一种检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒，该检测试剂或检测试剂盒含有上述的β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu。
[0019]本专利技术的第五个目的是提供一种用于检测肠球菌的选择性荧光肉汤培养基，该培养基含有50～400μMβ
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu、10～150万IU/L多粘菌素B、0.2～0.5g/L叠氮化钠和1～20g/L柠檬酸钠。
[0020]本专利技术的第六个目的是提供一种应用β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu的肠球菌检测方法，将β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu与至少包含多粘菌素B、叠氮化钠以及柠檬酸钠在内、但不含红四氮唑的物质配伍成选择性荧光肉汤培养基以用于检测肠球菌。
[0021]所述检测时β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu、多粘菌素B、叠氮化钠、柠檬酸钠在含待测样品的共孵育体系中的终浓度范围分别为50～400μM、10～150万IU/L、0.2～0.5g/L、1～20g/L。
[0022]所述检测时将上述选择性荧光肉汤培养基置于最大容积超过1mL的小型离心管或
多孔板中并在振荡培养下进行。
[0023]所述检测时采取将双倍料的上述选择性荧光肉汤培养基与待测样液以等体积比混合。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025](1)所述荧光底物CFMU
‑
Glu的合成方法简单，该荧光底物释放的荧光团具有较低的pK
a
值，在中性、偏酸性条件下被目标酶水解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu，其特征在于，其结构式如式(I)所示：2.一种制备权利要求1所述的β
‑
葡萄糖苷酶荧光底物CFMU
‑
Glu的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向4
‑
氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的混合物中加入甲烷磺酸，室温或加热下搅拌反应一段时间，然后加入冰冷水搅拌，过滤，热水洗涤，将所得固体用等体积比的乙醇
‑
水混合液进行重结晶，得到白色结晶体目标产物CFMU；(2)向上述所得目标产物CFMU与碳酸铯的混合物中加入乙腈，室温下搅拌，加入四乙酰溴代
‑
α
‑
D
‑
葡萄糖，于室温下继续搅拌反应，旋蒸去除溶剂，加入二氯甲烷提取，依次用稀氢氧化钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，分液，用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸去除溶剂，将所得固体用等体积比的乙醇
‑
水混合液热浸泡，冷却后过滤，得到白色固体目标物aCFMU
‑
Glu；(3)向aCFMU
‑
Glu的无水甲醇悬浊液中加入催化量的氢氧化钾
‑
甲醇溶液，室温下搅拌反应，然后旋蒸浓缩，过滤，用冷甲醇洗涤，即可得到白色固体目标荧光底物CFMU
‑
Glu。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的4
‑
氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1；所述的甲烷磺酸体积用量相对于4
‑
氯间苯二酚质量为3～15mL/g。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的CFMU、碳酸铯和四乙酰溴代
‑
α
‑
D
‑
葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦献虎，古其会，李滢，张友雄，卢勉飞，陈谋通，丁郁，吴诗，王涓，吴清平，张菊梅，冯颖，谢新强，张淑红，杨小鹃，郭伟鹏，万强，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：