本发明专利技术公开了一种构建高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌的方法和工艺，属于生物技术领域。该方法首先构建了包含P450酶基因与还原伴侣蛋白基因共表达重组大肠杆菌，对该重组大肠杆菌进行培养促使目标蛋白的大量表达，再采用静息细胞喂养法对甾体药物进行生物转化。该反应具有区域和立体选择性，同时，该重组菌对一些特定的甾体类药物的转化率达到100％。进行扩大培养，加入高浓度孕酮时，16α
【技术实现步骤摘要】
一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种构建高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌及应用。具体说，是通过构建一种含新型细胞色素P450酶ScyE与还原伴侣的共表达重组大肠杆菌对甾体药物进行生物转化从而获得16α
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羟基孕酮、16α
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羟基雄烯二酮、16α
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羟基睾酮等16α
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羟基甾体类化合物的方法。
技术介绍
[0002]甾体类药物是目前市场上最重要的药物之一，分布广泛，具有多种生理活性。至今为止，全球生产的甾体药物高达400多种，其中包括甾体激素类、甾体生物碱、甾体皂苷类等。近年来，随着甾体生物转化技术的不断发展，甾体药物被广泛应用于治疗风湿、心血管、胶原性疾病、淋巴性白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调等疾病。据统计，甾体激素药物销售额早在十年前就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％，成为产量第二大类药物，仅次于抗生素。
[0003]甾体类化合物是自然界广泛存在的一类天然化学成分，结构中具有环戊烷多氢菲甾体母核，而其生理功能取决于它们结构骨架中官能团的类型、数量和位置。因此，功能基团(如羟基化)的区域和立体选择性引入对于类固醇药物在广泛治疗应用中的生物活性很重要。例如，类固醇类药物的11
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羟基化在抗炎方面具有重要作用；19
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羟基化可用于合成炔诺酮、米非司酮、苯丙酸诺龙、替勃龙等多种高效甾体激素药物的中间体，具有巨大的市场价值；此外，16α
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羟基化是皮质类固醇合成中的一个重要反应，能够有效降低药物副作用又能维持其抗炎作用和糖代谢。甾体药物的工业生产主要通过改造天然的化合物而获得，但是应用化学方法改造时，合成步骤多，得率低，价格昂贵，因此寻找一种合理、高效的方法对甾体类药物进行羟基化修饰是至关重要的。细菌细胞色素P450单加氧酶能够以高度区域和立体选择性的方式在特定位置羟基化不同结构的甾体类药物，通过构建含P450酶及还原伴侣的重组大肠杆菌对甾体药物进行生物转化使得羟基化甾体药物的生产更加方便、经济，这对制药工业具有重要意义。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于公开了一种构建高产羟基化甾体原料药重组大肠杆菌的方法。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种构建高产羟基化甾体原料药重组大肠杆菌的方法与工艺，该方法包括以下步骤：
[0006]一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌通过如下方法构建获得：
[0007]利用DNA重组技术将scyE基因克隆至pT7NS
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camAB载体中，获得重组载体pET11::scyE::camA
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camB，将其导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述scyE基因序列为SEQ ID NO.1所示，载体pT7NS
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camAB的基因序列如SEQ ID NO.2所示，重组载体pET11::scyE::camA
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camB的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌的应用，具体为：
[0009](1)在OD
600
值为0.6
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0.8的重组大肠杆菌菌液中加入5
‑
氨基乙酰丙酸盐和异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷，同时将温度降至20℃，继续培养22h。其中，5
‑
氨基乙酰丙酸盐的浓度为0.5mM，异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷的浓度为0.2mM。
[0010](2)将步骤1培养得到的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10min，收集沉淀的菌体，并用预冷的磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，磷酸盐缓冲液的pH为7.2。收集洗涤后的菌体，将其悬浮于磷酸盐缓冲液中得到菌体磷酸盐缓冲液。
[0011](3)利用所述菌体磷酸盐缓冲液进行生物转化实现16α羟基化：将甾体原料药加入菌体磷酸盐缓冲液中在25℃下振荡反应24h。待反应结束后，加入等体积乙酸乙酯停止反应，对反应液中的产物进行提取、分离，得到16α
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羟基化甾体药物。
[0012]进一步地，所述步骤2中，悬浮的磷酸盐缓冲液为离心前的菌液的体积比为1:5。所述甾体原料药溶解在质量浓度为36％的助溶剂羟丙基
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β
‑
环糊精中，加入菌体磷酸盐缓冲液后的终浓度为0.1～1.5g/L。
[0013]进一步地，所述甾体原料药为孕酮、雄烯二酮、睾酮等。其中，孕酮经生物转化，得到16α
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羟基孕酮。雄烯二酮经生物转化，得到16α
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羟基雄烯二酮。睾酮经生物转化，得到16α
‑
羟基睾酮。
[0014]进一步地，pH为7.2的磷酸盐缓冲液由终浓度为50mM的磷酸盐和甘油组成，甘油体积为所述磷酸盐缓冲液的10％。
[0015]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种高产羟基化甾体原料药的方法及工艺，利用含新型P450酶及还原伴侣的重组大肠杆菌对甾体药物进行生物转化，得到16α
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羟基化甾体类化合物。该方法也证明了新型P450酶ScyE对孕酮、雄烯二酮和睾酮进行区域选择性单加氧化，并定向生成羟基化化合物。本专利技术的优势在于
①
本专利技术涉及的ScyE为一种新型细胞色素P450酶，其重组菌可转化孕酮、雄烯二酮和睾酮等甾体药物产生16α位羟基化产物，这些产物现阶段在工业上主要由化学合成方法获得，存在着合成方法困难、副产物多等缺陷，而本专利技术很好的解决了现阶段存在的问题；
②
ScyE对甾体类药物具有严格的区域选择性和立体选择性，可产生唯一产物即16α位羟基甾体类化合物，可有效分离提取到相应的产物；
③
本专利技术构建的催化体系可以在温和条件下选择性地进行氧化反应，相比于传统化学反应的复杂工艺流程，其在生物制药领域具有很大的应用价值；
④
本专利技术构建的催化体系在扩大规模时，对高浓度甾体药物依然保持较好的转化率，产量可观，在工业生产上具有极大的优势。
附图说明
[0016]图1为利用重组大肠杆菌生物转化甾体药物的流程图；
[0017]图2为实验样品的HPLC图谱，其中图2A为孕酮，图2B为雄烯二酮，图2C为睾酮；
具体实施方式
[0018]据我们的研究发现，含pET11::scyE::camA
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camB的重组大肠杆菌可催化甾体药物16α
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羟基化反应。据研究表明，16α
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羟基化是皮质类固醇合成中的一个重要反应，可以使药物副作用大大减少，但是可以使其抗炎和糖代本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌通过如下方法构建获得：利用DNA重组技术将scyE基因克隆至pT7NS
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camAB载体中，获得重组载体pET11::scyE::camA
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camB，将其导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述scyE基因序列如SEQ ID NO.1所示，载体pT7NS
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camAB的基因序列如SEQ ID NO.2所示，重组载体pET11::scyE::camA
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camB的基因序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌的应用，其特征在于，具体为：(1)在OD
600
值为0.6
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0.8的重组大肠杆菌菌液中加入5
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氨基乙酰丙酸盐和异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷同时将温度降至20℃，继续培养22h。其中，5
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氨基乙酰丙酸盐的浓度为0.5mM，异丙基
【专利技术属性】
技术研发人员：许莲花，林素素，高齐霖，杨建，朱俊源，孙珂珂，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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