基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了pCMV

【技术实现步骤摘要】
基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/CAS9系统是一种方兴未艾的新型基因编辑技术。与传统的基因编辑技术相比，该技术具有成本低廉、操作简单和编辑效率高等特点。CRISPR系统首次于1987年被日本科学家发现，其是一段被不同序列隔开的重复DNA片段。2002年，研究人员将具有这种特点的序列命名为CRISPRs。之后的许多研究表明，这种序列与细菌的获得性免疫有关。2012年开始，科学家首次在体外证明了CRISPR/Cas9特异性切割靶基因的功能，并对该系统进行改造和优化，使用sgRNA代替了crRNA和tracrRNA，使CRISPR系统更加简单方便，改造后的系统只需要sgRNA和Cas9蛋白两部分即可实现对特定靶基因的切割。目前，CRISPR/Cas9系统以其操作简单、编辑效率高、成本低的特点在动植物基因敲除与编辑中得到了广泛的利用，大大降低了基因编辑的门槛。
[0003]随着对CRISPR/Cas9系统的研究不断深入，科学家们已不再满足于对单基因的编辑，同时靶向多个DNA序列、多余敲除多个基因或染色特片段的多重基因组编辑技术，已经引起科学界的广泛关注并成为当今基因编辑技术的研究热点之一。目前，许多基于质粒的CRISPR/Cas9表达系统已经构建完成，但这些系统只适用于单个sgRNA的转染。当同时使用多个载体靶向多个基因座时，由于拷贝数的差异，共转染可能导致表达水平有变化。因此，科学家们尝试先将sgRNA表达框装载靶点序列，然后将多个装载后的sgRNA整合在同一个载体中，从而实现多个sgRNA表达框的共同表达。比较上述多sgRNA载体的构建我们可以发现，这些方法所能实现的sgRNA串联受限于其相关引物设计门槛较高，且其多次整合的方法也较为繁琐。
[0004]因此，不依赖多次合成以相对简便的步骤实现sgRNA多重表达的方案仍然有待进一步探索。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供了pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其制备方法和应用。
[0007]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体，所述表达载体包含Cas9蛋白、EGFP标记和4个表达sgRNA功能域的表达载体。
[0008]其中，所述表达载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本
技术实现思路
还包括基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体，所述多位点同时敲
除的CRISPR/Cas9载体是通过将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA载体中获得。
[0010]本
技术实现思路
还包括基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：
[0011]1)构建pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体，所述的载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0012]2)设计多对打靶位点，依据打靶位点合成多对用于合成靶向sgRNA的Oligo DNA，将每对Oligo DNA退火合成双链DNA；
[0013]3)使用酶切连接的方法将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA载体中，即合成靶向于多个基因靶点的单个载体。
[0014]其中，所述多位点为4个位点，所述步骤2)中设计4个打靶位点，所述4个打靶位点合成4对Oligo DNA，4对Oligo DNA退火合成双链DNA1～4，作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，基于CRISPR/Cas9规律与U6启动子规律，设计用于实现真核生物基因敲除的打靶位点，共计23或24个核苷酸，遵循以下规律：5
’‑
G(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑
NGG
‑3’
，其5
’
端须为G，或在5
’
端添加G。
[0015]在此基础上，构建的靶向于敲除位点的Oligo DNA对，分别具有以下规律：
[0016]正向Oligo DNA 1，5
’‑
CACCG(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；
[0017]反向Oligo DNA 1，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N)C
‑3’
；
[0018]正向Oligo DNA 2，5
’‑
CACCG(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；
[0019]反向Oligo DNA2，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N)C
‑3’
；
[0020]正向Oligo DNA 3，5
’‑
CACCG(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；
[0021]反向Oligo DNA 3，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N)C
‑3’
；
[0022]正向Oligo DNA 4，5
’‑
ACCG(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；
[0023]反向Oligo DNA 4，5
’‑
AACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N)C
‑3’
。其中，“(N)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN”分别为打靶位点1、2、3和4。
[0024]其中，作为优选的技术方案之一，所述步骤3)中的具体方法为：将质粒pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA使用Bbs I酶切，连接退火后的双链DNA 1，即获得重组质粒pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA
‑
DNA1；将质粒pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA
‑
DNA1使用Bsa I酶切，连接退火后的双链DNA 2，即获得重组质粒pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA
‑
DNA1
‑
DNA2；将质粒pCMV
‑
Cas9
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体包含Cas9蛋白、EGFP标记和4个表达sgRNA功能域的表达载体。2.根据权利要求1所述的pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体是通过将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA载体中获得。4.权利要求3所述的基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA表达载体，所述的载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；2）设计多对打靶位点，依据打靶位点合成多对用于合成靶向sgRNA的Oligo DNA，将每对Oligo DNA退火合成双链DNA；3）使用酶切连接的方法将多对靶向靶点基因的双链DNA片段重组至pCMV
‑
Cas9
‑
4xsgRNA载体中，即合成靶向于多个基因靶点的单个载体。5.根据权利要求4所述的基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述多位点为4个位点，所述步骤2）中设计4个打靶位点，所述4个打靶位点合成4对Oligo DNA，4对Oligo DNA退火合成双链DNA1~4，其中4对Oligo DNA分别具有以下规律：正向Oligo DNA 1，5
’‑
CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；反向Oligo DNA 1，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C
‑3’
；正向Oligo DNA 2，5
’‑
CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；反向Oligo DNA 2，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C
‑3’
；正向Oligo DNA 3，5
’‑
CACCG（N）NNNNNNNNNNNNNNNNNNN
‑3’
；反向Oligo DNA 3，5
’‑
AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（N）C
...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠辉明，徐磊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：