一种10-羟基新乌头碱半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种10

【技术实现步骤摘要】
一种10-羟基新乌头碱半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种10-羟基新乌头碱半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用，属于食品安全领域。

技术介绍

[0002]10-羟基新乌头碱是新乌头碱的体内代谢产物之一，它具有乌头类生物碱的公共母环结构，同时也具有较大的毒性。乌头生物碱广泛存在于川乌、草乌、附子等乌头属中药材中，在中国、日本、韩国等国家广泛被用于治疗外感风寒湿邪所致的各种疼痛。然而，这些化合物具有极大的毒性，可损伤神经系统和心血管系统，严重可引起死亡。《中国药典》2015年版中规定，按干燥品算，乌头属中药材中以新乌头碱、次乌头碱、和乌头碱的总量计双酯型生物碱不得过0.04％，以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的总量计范围为0.01％～0.15％。
[0003]目前，《中国药典》2015年版中对乌头属中药材中乌头类有毒生物碱的检测常采用高效液相色谱法。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选检测。免疫分析法(如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析法)，由于在抗原抗体的定性、定量方面独特的优势和操作简便、分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在乌头类有毒生物碱的检测中起着越来越重要的作用
[0004]免疫学检测方法的核心试剂是抗体。目前有关报道乌头类有毒生物碱免疫学检测的抗体有单抗和多抗。虽然多抗制备成本低且周期短，但是由于多抗可识别多个结构域，易产生大量非特异性抗体，批次间差异大，无法标准化等不足，不适用于识别特异性抗原结构。单抗相比于多抗，具有更高的特异性和灵敏度，更好的稳定性，且可“无限量”地从一株杂交瘤细胞获得均一性单抗，更加适用于免疫学分析方法。
[0005]高灵敏特异性抗体制备的前提是抗原的制备。乌头碱和苯甲酰新乌头原碱性质均不太稳定，在加热或碱性条件下易水解成无酯型生物碱。在半抗原合成到免疫动物的过程中，人工抗原的质量不确定，可能完全或部分改变了乌头生物碱的抗原决定簇，导致制备的抗体灵敏度不够高，甚至不能刺激机体产生抗乌头生物碱抗体。因此需要提供一种新的乌头生物碱抗原。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种10-羟基新乌头碱抗原，基于该类抗体的交叉反应性，利用10-羟基新乌头碱具有乌头生物碱的母环结构与其结构的稳定性，建立一种有效识别乌头生物碱的抗体，为研发高灵敏的乌头生物碱免疫学检测方法奠定了基础，对药品安全的监控具有重要意义。
[0007]本专利技术所提供的10-羟基新乌头碱半抗原，其结构式如式Ⅰ所示；
[0008][0009]本专利技术所述10-羟基新乌头碱半抗原可按照下述方法制备：
[0010]以吡啶作为溶剂，10-羟基新乌头碱和丁二酸酐进行反应，即得所述10-羟基新乌头碱半抗原；
[0011]具体地，所述10-羟基新乌头碱与所述丁二酸酐的摩尔比为1：100～105；
[0012]所述反应的温度为室温(25℃左右)，所述反应的时间为24～36h；
[0013]反应结束后采用乙酸乙酯萃取反应体系，去除有机相后干燥即得。
[0014]本专利技术还提供了一种10-羟基新乌头碱人工抗原，由所述10-羟基新乌头碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；
[0015]所述载体蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白；
[0016]所述10-羟基新乌头碱半抗原与所述载体蛋白的偶联摩尔比约为2.7：1；
[0017]可采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基上得到所述10-羟基新乌头碱人工抗原。
[0018]所述10-羟基新乌头碱半抗原或所述10-羟基新乌头碱人工抗原具有下述应用：
[0019]1)制备抗10-羟基新乌头碱抗体；
[0020]2)检测药品中10-羟基新乌头碱的残留。
[0021]本专利技术还提供了一种10-羟基新乌头碱的单克隆抗体，通过所述10-羟基新乌头碱的人工抗原免疫实验动物(雌性BALB/c小鼠)，产生抗血清，通过ELISA筛选出分泌抗10-羟基新乌头碱单克隆抗体的杂交瘤细胞，制备得到10-羟基新乌头碱单克隆抗体，该抗体的灵敏度高且具有广谱性，可交叉识别乌头类生物碱(主要为10-羟基新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等双酯型生物碱和苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱等单酯型生物碱)。10-羟基新乌头碱为新乌头碱的体内代谢物之一，在体内能更加稳定地存在。当作为免疫原进入机体后，不易发生抗原决定簇的丢失，在机体中可以持续刺激机体产生免疫应答。
[0022]基于本专利技术提供的广谱特异性抗体可用于建立乌头类生物碱的酶联免疫、化学发光、时间分辨、荧光偏振等免疫学检测方法，并可制备乌头生物碱的试剂盒检测产品，适用于大量样品检测及现场快速检测。
附图说明
[0023]图1为10-羟基新乌头碱半抗原的质谱鉴定图。
[0024]图2为10-羟基新乌头碱完全抗原的制备路线图。
[0025]图3为本专利技术半抗原与牛血清白蛋白的偶联物的MALDI-TOF-MS图，其中，图3(A)为
牛血清白蛋白的MALDI-TOF-MS图，图3(B)为偶联物的MALDI-TOF-MS图。
[0026]图4为本专利技术利用单克隆抗体检测10-羟基新乌头碱的标准曲线图。
具体实施方式
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]下述实施例所用实验材料主要为：
[0030]1、试剂
[0031]10-羟基新乌头碱(10-Hydroxy mesaconitine，10-HM)、乌头碱(Aconitine，AC)、次乌头碱(Hypaconitine，HA)、新乌头碱(Mesaconitine，MA)、苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine，BA)、苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconine，BH)、苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine，BM)、乌头原碱(Aconine)、次乌头原碱(Hypaconine)、新乌头原碱(Mesaconine)、倒千里光碱(Retrorsine，RTS)、野百合碱(Monocrotaline，MCT)等毒素标准品购自成都曼斯特生物科技有限公司、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、3,3
’
,5,5
’-
四甲基联苯胺(TMB)、弗氏完全佐剂(FCA)及弗氏不完全佐剂(FIA)购自于Sigma-Aldrich公司。其他试剂均购自于市售，均为国产分析纯或更高级别试剂。
[0032]2、溶液
[0033]0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，室温保存。0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.式Ⅰ所示10-羟基新乌头碱半抗原；2.权利要求1所述10-羟基新乌头碱半抗原的制备方法，包括如下步骤：以吡啶作为溶剂，10-羟基新乌头碱和丁二酸酐进行反应，即得所述10-羟基新乌头碱半抗原。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述10-羟基新乌头碱与所述丁二酸酐的摩尔比为1：100～105；所述反应的温度为室温，所述反应的时间为24～36h。4.一种10-羟基新乌头碱人工抗原，由权利要求1所述10-羟基新乌头碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。5.权利要求4所述10-羟基新乌头碱人工抗原的制备方法，包括如下步骤：采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于权利要求1所述半抗原的羧基上即得。6.权利要求1所述10-羟基新乌头碱半抗原或权利要求4所述10-羟基新乌头碱人工抗原在下述1)或2)中的应用：1)制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，王战辉，史为民，任祯慧，温凯，郑丕苗，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：