一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法。所述试剂盒包括引物混合液、PCR酶、PCR缓冲液、内参和校准品，所述引物混合液包括扩增4种管家基因的引物对，所述引物对扩增的PCR产物的长度不同，4个PCR产物长度相差分别不小于90bp，且长度范围分布在50bp

【技术实现步骤摘要】
一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法。

技术介绍

[0002]在分子生物学基因检测中，核酸完整性是极重要的质控指标之一，如全基因组测序、全外显子测序以及PCR扩增等，都要求核酸完整，否则实验会面临检测结果较差甚至失败的风险。对于基因检测，常用的石蜡包埋组织样本、放置很久的血液样本，法医鉴定取得的降解严重的样本，其核酸完整性往往都比较差，会导致后续的检测结果较差甚至失败。因此，在进行核酸样本检测前，需要对核酸完整性进行评估，所以需要一种准确且高灵敏度的核酸完整性评估方法。
[0003]目前检测核酸完整性的方法主要有Nanodrop法、Qubit法、Q
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PCR法和凝胶电泳法等。Nanodrop法为利用分光光度计检测核酸的浓度，原理为核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和核酸的紫外吸收峰在260 nm波长处，此法操作简便，迅速，但若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测量误差较大，且NanoDrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测，它无法区分出完整核酸、降解核酸、游离核苷酸及其它一些杂质；Qubit是新一代的核酸和蛋白定量仪器，它可以采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，染料只有与核酸、RNA或蛋白结合后才能发出荧光，即使有游离核苷酸或降解核苷酸时也是如此，所以缺点就是对于降解的核酸，只要是有双链结构就会发出荧光，会导致有效浓度产生偏差；Q
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PCR大部分是设计几对内参引物探针，分别对样本进行扩增，根据标准品检测未知样本浓度，缺点是反应个数非常多；凝胶电泳是将样本进行电泳，根据电泳条带判断样本降解程度，凝胶电泳法判断样本浓度比较粗糙，人为判读误差较大，且灵敏度非常低，只有在大于10 ng时条带才能比较明显。
[0004]综上所述，如何提供一种能够准确、快速评估核酸完整性的产品及方法，是分子生物学领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法，能够有效评估样本中核酸完整性，灵敏度高，准确性好。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种核酸完整性评估试剂盒，所述试剂盒包括引物混合液、PCR酶、PCR缓冲液、内参和校准品，所述引物混合液包括扩增4种管家基因的引物对，所述引物对扩增的PCR产物的长度不同，4个PCR产物长度相差分别不小于90bp，且长度范围分布在50bp
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1000bp之间，所述内参包括所述4种管家基因的核酸片段，所述内参的核酸片段的序列较原管家基因核酸片段序列增加至少2 bp，且增加位置在所述引物对扩增片段内的非引物结合区，所述校准品包括人标准基因组DNA。
[0007]本专利技术的核酸完整性评估试剂盒，分别对待测样本和校准品的4种管家基因（例如
GAPDH基因、TBXAS1基因、AF4基因和PLZF基因）进行PCR扩增，同时内参也在同一体系中进行PCR扩增，然后对所有PCR产物进行毛细管电泳，来评估核酸完整性。毛细管电泳结果可分别得到待测样本管中待测样本各基因的峰高和内参相应基因的峰高，以及校准品管中校准品各基因的峰高和内参相应基因的峰高，从而可计算出待测样本和校准品中各基因与其内参相应基因的峰高比，即待测样本各基因峰高/相应基因内参峰高以及校准品各基因峰高/相应基因内参峰高。将待测样本中各基因的峰高比与校准品中对应基因的峰高比进行比较，即可判断样本核酸完整性。其中，内参中各管家基因的核酸片段设计增加了至少2 bp，使其出峰位置与样本不同，作为体系内部对照，用于校正操作误差及毛细管运行之间的差异，及样本或体系中可能存在的抑制剂的影响产生的差异，可显著提高检测的准确性。
[0008]本专利技术中，在细胞中稳定表达管家基因均适用于本专利技术的技术方案。
[0009]优选地，所述4种管家基因包括GAPDH基因、TBXAS1基因、AF4基因和PLZF基因。
[0010]优选地，所述GAPDH基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.6所示的序列。
[0011]优选地，所述TBXAS1基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.8所示的序列。
[0012]优选地，所述AF4基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.10所示的序列。
[0013]优选地，所述PLZF基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.12所示的序列。
[0014]优选地，所述引物对中至少一条引物具有荧光基团修饰，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、PET、TAMRA或NED。
[0015]优选地，所述GAPDH基因的PCR产物的长度为100~120 bp（包括但不限于101 bp、102 bp、103 bp、104 bp、105 bp、110 bp、112 bp、113 bp、115 bp、116 bp、117 bp、118 bp或119 bp），所述TBXAS1基因的PCR产物的长度为180~200 bp（包括但不限于181 bp、182 bp、183 bp、184 bp、185 bp、190 bp、192 bp、193 bp、195 bp、196 bp、197 bp、198 bp或199 bp），所述AF4基因的PCR产物的长度为280~300 bp（包括但不限于281 bp、282 bp、283 bp、284 bp、285 bp、290 bp、292 bp、293 bp、295 bp、296 bp、297 bp、298 bp或299 bp），所述PLZF基因的PCR产物的长度为380~400 bp（包括但不限于381 bp、382 bp、383 bp、384 bp、385 bp、390 bp、392 bp、393 bp、395 bp、396 bp、397 bp、398 bp、399 bp或400bp）。
[0016]本专利技术中，针对GAPDH基因、TBXAS1基因、AF4基因和PLZF基因这4个基因分别设计不同长度的PCR产物，覆盖100～400 bp，在常规的Q
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PCR、数字PCR(ddPCR)、NGS建库等检测中的产物长度一般不超过400 bp，所以设计以上长度的片段能满足绝大多数的检测实验要求，覆盖比较全面。1）PLZF基因的PCR产物的长度为380~400 bp，能够考察样本中400 bp以内核酸的完整性，若待测样本中PLZF基因与相应内参的毛细管电泳峰高比不低于校准品中PLZF基因的峰高比，表明该样本的核酸完整性非常好，评分10分，可安全用于后续Q
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PCR、ddPCR、NGS等检测；2）AF4基因的PCR产物的长度为280~300 bp，能够考察样本中300 bp以内核酸的完整性，若待测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸完整性评估试剂盒，其特征在于，所述核酸完整性评估试剂盒包括引物混合液、PCR酶、PCR缓冲液、内参和校准品；所述引物混合液包括扩增4种管家基因的引物对，所述引物对扩增的PCR产物的长度不同，4个PCR产物长度相差分别不小于90bp，且长度范围分布在50bp
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1000bp之间；所述内参包括所述4种管家基因的核酸片段，所述内参的核酸片段的序列较原管家基因核酸片段序列增加至少2 bp，且增加位置在所述引物对扩增片段内的非引物结合区；所述校准品包括人标准基因组DNA。2.根据权利要求1所述的核酸完整性评估试剂盒，其特征在于，所述4种管家基因包括GAPDH基因、TBXAS1基因、AF4基因和PLZF基因。3. 根据权利要求2所述的核酸完整性评估试剂盒，其特征在于，所述GAPDH基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.6所示的序列；所述TBXAS1基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.8所示的序列；所述AF4基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.10所示的序列；所述PLZF基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.12所示的序列；所述引物对中至少一条引物具有荧光基团修饰，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、PET、TAMRA或NED。4. 根据权利要求2所述的核酸完整性评估试剂盒，其特征在于，所述GAPDH基因的PCR产物的长度为100~120 bp；所述TBXAS1基因的PCR产物的长度为180~200 bp；所述AF4...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛秋红，王洁，贺文慧，张亚飞，林东旭，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：