一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术针对组学鉴定的批量miRNA

【技术实现步骤摘要】
一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用。

技术介绍

[0002]miRNA是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA，是真核生物中几乎所有生物过程的关键调控因子。在植物体内，miRNA能够通过与靶mRNA分子的互补序列结合，使其降解或抑制其翻译，在转录后水平调控靶基因的表达，一直是遗传、发育、干细胞等多个研究领域中的研究热点。例如，miR165/miR166通过影响HD
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ZIP III转录因子基因的表达，调控SAM终止、器官极性改变和维管组织和束间纤维发育缺陷等。同时Argonautes(AGOs)通过竞争性结合miRNA165/166调控拟南芥茎端分生组织发育和叶片极性形成。这些结果均表明miRNA能够联合上游调控基因和下游靶基因，在植物的胚胎发育、分生组织和器官发生等关键发育过程中发挥重要作用。
[0003]此外，miRNAs通过参与调控植物物质和能量代谢、植物激素信号传导以及逆境响应相关生物学途径，影响植物的发育与形态建成。如microRNA165/166能够联合植物激素信号传导途径共同维持拟南芥根部维管束构型的稳定(Muraro et al.,2014)。以往研究成果显示几乎所有miRNAs均受到多个转录因子的调控，同时miRNAs也作用于包括转录因子基因的众多靶基因。不仅如此，转录因子通过特异结合下游基因启动子区的DNA顺式作用元件，对基因(包括miRNA)的转录起到激活或者抑制等作用，形成“miRNA
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转录因子
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靶基因(miRNA)”组成的较为复杂的转录调控网络，参与包括植物生长和发育的多个生物通路。即miRNA通过与上游调控基因和下游靶基因构成复杂调控网络，参与植物的物质和能量代谢、激素信号转导和逆境胁迫响应等多生物过程，在转录水平调控植物的生长发育。
[0004]目前也有利用miRNA研究植物生长发育的相关记载，比如，研究报道“Integrated Analysis of Small RNA,Transcriptome and Degradome Sequencing Provides New Insights into Floral Development and Abscission in Yellow Lupine(Lupinus luteus L.)”和“Integrated transcriptome,small RNA and degradome sequencing approaches provide insights into Ascochyta blight resistance in chickpea”中团队均发掘得到了候选的miRNA，检测到了差异表达的miRNA，虽然进行了降解组检测，找到了部分miRNA降解靶基因位点，但是混样后很难确定miRNA
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靶基因对是否来自相同的生长发育时期，即只是在序列上存在互作关系，存在假阳性。虽然运用qRT
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PCR检测到两者表达量存在负相关关系，但是没有对候选miRNA
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靶基因对在细胞中是否能够互作进行验证，也没有对miRNA和靶基因在植物组织中的位置进行明确，存在很高的假阳性概率。利用找到的候选miRNA及其靶基因构建了调控网络，但由于关键节点miRNA及其靶基因存在很高的假阳性概率，也是不能真正反映植物发育过程，对指导育种的价值不大。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种构建植物发育分子调控网络的方法及其应用，能够精确地实现节点基因和miRNA在发育组织中的定位，从而精确地、具有时空特异性地反映植物组织发育过程分子调控的特点。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种构建植物发育分子调控网络的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]对植物组织基因文库进行测序得到miRNAs
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靶基因对；
[0009]利用双荧光素酶报告检测技术验证所述miRNAs
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靶基因对，然后通过荧光原位杂交技术对所述miRNAs
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靶基因对在植物组织细胞中作用位置进行定位后即可获得所述的植物发育分子调控网络。
[0010]优选的，所述测序包括转录组测序、小RNA测序和降解组测序。
[0011]优选的，所述转录组测序包括：
[0012]对植物组织基因文库进行测序、数据分析、筛选得到不同植物组织发育时期差异表达的基因。
[0013]优选的，所述小RNA测序包括：
[0014]对植物组织基因文库进行测序、数据分析、筛选得到植物相邻发育时期差异表达的miRNAs，并预测所述miRNAs的靶基因。
[0015]优选的，所述降解组测序包括：
[0016]对植物组织基因文库进行测序，将测序得到的cluster Tags与Rfam数据库进行比对获得未被注释的序列，然后对所述未被注释的序列进行分析获得降解位点，经分析筛选得到所述miRNAs
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靶基因对。
[0017]优选的，所述植物组织基因文库为根据植物组织RNA构建所得的cDNA文库。
[0018]优选的，所述验证包括如下步骤：
[0019]利用双荧光素酶检测所述的miRNAs
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靶基因对，得到检测结果为阳性的miRNA
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靶基因对。
[0020]优选的，所述定位包括如下步骤：
[0021]将所述检测结果为阳性的miRNA
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靶基因对进行荧光原位杂交，观察miRNA与靶基因是否两两都能够定位在样本的同一组织。
[0022]优选的，根据所述miRNA与靶基因的定位位置，运用cytoscape软件绘制即可得到可视化的所述植物发育分子调控网络。
[0023]本专利技术还提供了上述的方法或利用该方法构建得到的分子调控网络在指导分子育种中的应用。
[0024]本专利技术提供了一种构建植物发育分子调控网络的方法，针对组学鉴定的批量miRNA
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靶基因对，先后运用双荧光素酶报告检测技术和荧光原位杂交技术验证候选miRNA及其靶基因的互作关系并定位其在组织和细胞中的位置，精确地实现了节点基因和关键开关miRNA在发育组织中的定位，能够精确地、具有时空特异性地反映植物组织发育过程分子调控的特点，对分子设计育种具有很高的指导意义和应用价值。
附图说明
[0025]图1为小RNA测序和数据分析流程。
[0026]图2为降解组实验流程图。
[0027]图3为降解组数据分析流程图。
[0028]图4为荧光原位杂交Fish实验定位ped
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miR160a
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5p能够在笋芽发育早期的原形成层(箭头1)发挥作用。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建植物发育分子调控网络的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：对植物组织基因文库进行测序得到miRNAs
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靶基因对；利用双荧光素酶报告检测技术验证所述miRNAs
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靶基因对，然后通过荧光原位杂交技术对所述miRNAs
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靶基因对在植物组织细胞中作用位置进行定位后即可获得所述的植物发育分子调控网络。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序包括转录组测序、小RNA测序和降解组测序。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转录组测序包括：对植物组织基因文库进行测序、数据分析、筛选得到不同植物组织发育时期差异表达的基因。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小RNA测序包括：对植物组织基因文库进行测序、数据分析、筛选得到植物相邻发育时期差异表达的miRNAs，并预测所述miRNAs的靶基因。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述降解组测序包括：对植物组织基因文库进行测序，将测序得到的cluster Tags与Rfam数据库进行比对获得未被注释的序列，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英，高志民，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：