一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法技术

本发明专利技术属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，方法包括如下步骤：刀豆研磨成粉，加入提取液，离心收集上清液；室温条件下向上清液中低速缓慢加入PEG溶液，冰箱静置，离心后收集沉淀；将所得沉淀进行重悬，抽滤后上清过凝胶层析，首先流出的部分为脲酶，之后洗脱的部分为刀豆凝集素；得到脲酶与刀豆凝集素的上清液，分别加入硫酸铵粉末充分溶解，冷藏，离心后收集沉淀；将沉淀用透析液溶解后进行透析，透析结束后低温离心，收取上清进行冷冻干燥。本发明专利技术方法具有工艺简单、易于操控、成本相对较低的特点；用该方法制备的碳化晶须具有数量多、长径比大、纯度高和应用前景大的优点。纯度高和应用前景大的优点。纯度高和应用前景大的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法


[0001]本专利技术属于生物蛋白提取
，具体涉及一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法。

技术介绍

[0002]我国地域辽阔，豆类资源十分丰富。豆类脂肪含量低，富含纤维素、蛋白质等营养物质，是极佳的食用作物，在我国广泛种植，此外从豆类中提取出的许多化合物作为酶制剂在多种领域发挥重要作用，例如脲酶和刀豆凝集素。刀豆中同时富含大量脲酶和刀豆凝集素，同时提取两种蛋白的技术具有相当大的实际价值。
[0003]脲酶是一种寡聚酶，可以特异性的催化尿素分解生成氨和二氧化碳，其催化效率远高于无机催化剂且反应条件温和，反应进行迅速。最初脲酶于1962年被美国科学家从刀豆中提取分离得到并凭借这一成果成功夺得诺贝尔奖。现如今脲酶在多个领域都发挥着重要的作用；在环境治理方面，脲酶被用于处理富含尿素的污水，是污水处理的重要一步；在生物医药方面，脲酶被应用于多种检测传感器的开发和尿素检测试剂盒；在酿酒行业，重组酸性脲酶被用于对黄酒中尿素和隐性致癌物质氨基甲酸乙酯的降解；在工业生产上，固定化脲酶与其它酶联用在调节级联酶促反应的pH上发挥重要作用。凝集素是一类具有糖专一性、可以促进细胞凝集的蛋白质或糖蛋白；它们在自然界中广泛存在且在多种生命活动中都发挥了重要作用，包括刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂、诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子、促进巨噬细胞的吞噬作用、使细胞凝集和使肿瘤细胞失活等。相关研究表明，来自于植物的植物凝集素在生物防治、恶性疾病诊断、诱导癌细胞凋亡以及抗真菌、病毒等方面具有巨大潜力。
[0004]目前国内外对于从植物中提取脲酶的研究已经取得了一些成果。庄一义在“从巨豆粉提取脲酶”一文中提到了一种提取纯化尿素酶的方法，将巨豆用氯仿和丙酮脱脂，然后采用低浓度的丙酮进行提取，冷冻放置使其沉淀，沉淀经缓冲液溶解后葡聚糖凝胶柱分离即可得到高活性的脲酶。刘东凯等人在“大豆脲酶的提取及其影响因素研究”一文中也提及了有关脲酶提取的方法并对其影响因素进行了考查，确定最佳提取方法，采用30％乙醇从大豆中提取尿素酶，固液比为1：10，最适pH值为7。崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE
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纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后即可得到比活为67.15IU/mg的尿素酶产品。上述文献中提到了几种对脲酶的提取纯化方法，但是大部分提取成本较高，整个工艺实施时间较长。有的工艺中多次采用低含量丙酮，导致回收成本大幅度提高，且造成一定的环境污染。
[0005]相比于脲酶针对ConA(刀豆凝集素)提取的研究相对较少。现存对于刀豆凝集素的提取方法主要是盐析沉淀法，中国专利CN103570814A中提出了一种ConA的提取方法，具体操作流程如下：首先使用75～80％的乙醇浸泡刀豆30min，烘干24h后进行破碎，再使用生理盐水对刀豆粉末进行抽提24h，抽提结束后进行硫酸铵沉淀24h、凝胶层析纯化再用生理盐
水洗；中国专利CN101340923A中涉及到使用乙醇沉淀的方法来制备植物凝集素的方法；低温提取的方法主要问题是耗时较长且最终得到的成品纯度较低。中国专利CN101508730A中公开了一种从豆类中提取凝集素的方法，具体是：使用40
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60℃水提法，并辅助超声和微波的交替施加的方法来提取植物凝集素，对得到凝集素粗品再进行硫酸铵沉淀，透析干燥得到凝集素，该方法克服了低温提取时间较长以及较多化学试剂残留的问题，但同其他使用乙醇或硫酸铵沉淀的方法相同，最终所得成品纯度不高这一问题依然存在。现存的凝集素提取方法主要存在工艺时间较长，最终所得成品纯度较低，蛋白稳定性较差的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，操作简单、工艺周期较短、得到的最终产物纯度较高且一次提取可同时获得脲酶和刀豆凝集素，大大提高了原料的利用率。
[0007]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：
[0008]一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，包括如下步骤：
[0009]1)提取：称取刀豆并研磨成粉，过筛后加入提取液，室温下将刀豆粉末和提取液充分搅拌均匀，使刀豆粉末中的脲酶和刀豆凝集素充分浸出，在室温下将混合物进行离心，收集上层清液；
[0010]2)PEG沉淀：在室温条件下向得到的上清液中低速缓慢加入PEG溶液混合均匀，将溶液转移至冰箱中静置，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；
[0011]3)SepHadexG～50凝胶层析：对SepHadexG～50凝胶柱使用平衡Buffer进行平衡，向得到的沉淀中加入Wash Buffer重悬，进行抽滤后将重悬后的液体使用SepHadexG～50凝胶进行层析并依次使用Wash Buffer冲洗、Elution Buffer进行洗脱，Wash Buffer冲洗流出的液体为刀豆脲酶溶液，之后通过Elution Buffer洗脱收集到的洗脱液为刀豆凝集素溶液；
[0012]4)硫酸铵沉淀：向得到的刀豆脲酶溶液、刀豆凝集素溶液中分别低速缓慢加入硫酸铵固体粉末，待到硫酸铵粉末完全溶解后，将溶液转移至冰箱中静置进行沉淀，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；
[0013]5)透析冻干：将得到的沉淀按照一定比例分别使用透析液进行溶解，之后进行离心，收集上清液，将收集到的上清液加入到透析袋中，再放置到冰箱中使用磁力搅拌器进行透析，透析结束后进行低温离心，离心结束后收集上层清液，对上层清液进行冷冻干燥得到刀豆脲酶晶体和刀豆凝集素晶体。
[0014]进一步地，步骤1)中，刀豆磨成粉后采用孔径80目的筛网进行筛分，筛除较大颗粒、保留粉末。
[0015]进一步地，步骤1)中，提取液的成分含有终浓度3％的PEG4000～8000、溶剂为25mM的柠檬酸
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柠檬酸钠缓冲液。
[0016]进一步地，步骤1)中，刀豆、提取液按照1g:5ml的料液比进行混合。
[0017]进一步地，步骤2)中，PEG溶液为PEG4000～PEG8000溶液，添加终浓度为10％。
[0018]进一步地，步骤2)中，下层沉淀进行重悬，重悬Buffer成分为50mM Tris
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HCl、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。
[0019]进一步地，步骤3)中，Wash Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl的50mM柠檬酸
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柠檬酸钠缓冲液，Elution Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl、100mM葡萄糖的50mM柠檬酸
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柠檬酸钠缓冲液。
[0020]进一步地，步骤4)中，所述刀豆脲酶溶液中硫酸铵的沉淀浓度为30％(m/v)，所述刀豆凝集素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取：称取刀豆并研磨成粉，过筛后加入提取液，室温下将刀豆粉末和提取液充分搅拌均匀，使刀豆粉末中的脲酶和刀豆凝集素充分浸出，在室温下将混合物进行离心，收集上层清液；2)PEG沉淀：在室温条件下向得到的上清液中低速缓慢加入PEG溶液混合均匀，将溶液转移至冰箱中静置，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；3)SephadexG～50凝胶层析：对SephadexG～50凝胶柱使用平衡Buffer进行平衡，向得到的沉淀中加入Wash Buffer重悬，进行抽滤后将重悬后的液体使用SephadexG～50凝胶进行层析并依次使用Wash Buffer冲洗、Elution Buffer进行洗脱，Wash Buffer冲洗流出的液体为刀豆脲酶溶液，之后通过Elution Buffer洗脱收集到的洗脱液为刀豆凝集素溶液；4)硫酸铵沉淀：向得到的刀豆脲酶溶液、刀豆凝集素溶液中分别低速缓慢加入硫酸铵固体粉末，待到硫酸铵粉末完全溶解后，将溶液转移至冰箱中静置进行沉淀，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；5)透析冻干：将得到的沉淀按照一定比例分别使用透析液进行溶解，之后进行离心，收集上清液，将收集到的上清液加入到透析袋中，再放置到冰箱中使用磁力搅拌器进行透析，透析结束后进行低温离心，离心结束后收集上层清液，对上层清液进行冷冻干燥得到刀豆脲酶晶体和刀豆凝集素晶体。2.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤1)中，刀豆磨成粉后采用孔径80目的筛网进行筛分，筛除较大颗粒、保留粉末。3.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤1)中，提取液的成分含有终浓度3％的PEG4000～8000、溶剂为25mM的柠檬酸
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柠檬酸钠缓冲液。4.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婷婷，郑梦泽，周倩，
申请(专利权)人：伊势久江苏连云港生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：